【摘要】：為建立檢測(cè)山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)血清抗體的間接ELISA方法,采用PCR方法擴(kuò)增山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒CA蛋白編碼基因序列,然后克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+),誘導(dǎo)含有重組載體pET-28a(+)-CA的大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)重組蛋白rHis-CA。采用Ni柱親和層析方法純化重組蛋白rHisCA,并以純化的rHis-CA為包被抗原建立檢測(cè)山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎血清抗體的間接ELISA方法。結(jié)果表明重組蛋白rHis-CA以包涵體形式表達(dá),具有良好的反應(yīng)原性。所建立的rHis-CA間接ELISA方法的最適抗原包被質(zhì)量濃度和血清稀釋度分別為0.4 μg/mL和1∶100,血清陰陽(yáng)性的D_(450)臨界值為0.45。該方法僅與山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),不與山羊痘病毒、藍(lán)舌病病毒和口蹄疫病毒陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。對(duì)來(lái)自陜西地區(qū)的48份山羊血清進(jìn)行CAEV抗體檢測(cè),rHis-CA ELISA和瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率分別為35.41%(17/48)和31.25%(15/48)。對(duì)來(lái)自天津地區(qū)2個(gè)山羊場(chǎng)的240份山羊血清樣本進(jìn)行CAEV抗體檢測(cè),rHis-CA ELISA方法和瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
【圖文】：

的敏感性。1.6.4重復(fù)性試驗(yàn)取1塊rHis-CA抗原包被的ELISA板，按優(yōu)化的rHis-CA間接ELISA方法同時(shí)檢測(cè)6份山羊血清樣品，每份血清做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算同批次組內(nèi)的變異系數(shù)。另取3塊不同批次的rHis-CA抗原包被的ELISA板，，同法檢測(cè)6份山羊血清樣品，每份血清做3個(gè)重復(fù)，計(jì)算不同批次間的變異系數(shù)。1.7臨床血清樣本檢測(cè)采用優(yōu)化的rHis-CA間接ELISA方法對(duì)288份山羊血清樣本中的CAEV抗體進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）的檢測(cè)結(jié)果做比較。2結(jié)果2.1重組表達(dá)載體的鑒定重組質(zhì)粒pET-28（＋）-CA的鑒定結(jié)果（見圖1）顯示，用特異性引物和通用引物對(duì)重組質(zhì)粒pET-28（＋）-CA進(jìn)行PCR鑒定，分別擴(kuò)增出706和893bp的預(yù)期片段，用BamHⅠ＋XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-28（＋）-CA得到709bp的目的片段，表明插入載體的CA基因片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)插入載體的CA基因片段序列正確，無(wú)移碼和突變現(xiàn)象發(fā)生。2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化重組蛋白rHis-CA的表達(dá)和純化結(jié)果見圖2。由圖2可見，在誘導(dǎo)后菌體和超聲后菌體沉淀中均有1條預(yù)期大小的特異蛋白條帶，表明該重組蛋白是以包涵體的形式表達(dá)。隨后，采用包涵體溶解及Ni柱親和層析純化方法獲得了較高純度的重組蛋白rHis-CA。2.3重組蛋白抗原性的鑒定用CAEV陽(yáng)性山羊血清對(duì)純化的rHis-CA蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示有預(yù)期的目的反應(yīng)條帶出現(xiàn)（見圖3），表明該重組蛋白具有與CAEV陽(yáng)性血清反應(yīng)的抗原性。2.4rHis-CAELISA檢測(cè)方法的建立2.4.1最適抗原包被濃度和血清稀釋度的確定試驗(yàn)結(jié)果見表1，當(dāng)陽(yáng)性血清D450在1.00左右時(shí)，綜合考慮陰陽(yáng)性血清的D值比值（P/N）和血清稀釋度，確定His-CA重組蛋白的包被質(zhì)量濃度為0.4g/mL，血清稀釋度為1∶

onenzymedigestionidentificationoftherecombinantplasmidpET-28a（+）-CAM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-28a（＋）-CA的酶切產(chǎn)物；2：pET-28a（＋）-CA的通用引物PCR產(chǎn)物；3：pET-28a（＋）-CA的特異性擴(kuò)增引物PCR產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照M：DL2000plusDNAMarker；1：RestrictionenzymedigestionproductsfrompET-28a（＋）-CA；2：PCRproductofpET-28a（＋）-CAbyuniversalprimers；3：PCRproductofpET-28a（＋）-CAbyspecificprimers；4：NegativecontrolM12345000bp3000bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp圖2His-CA重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2SDS-PAGEanalysisofrHis-CAfusionproteinM：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：rHis-CA蛋白的純化產(chǎn)物；3：pET-28a（＋）-CA菌裂解上清；4：pET-28a（＋）-CA菌裂解沉淀；5：誘導(dǎo)4h后pET-28a（＋）-CA全菌蛋白；6：pET-28a（＋）-CA未誘導(dǎo)產(chǎn)物M：ProteinmolecularweightMarker；1，2：PurifiedrHis-CAprotein；3：SupernatantsofpET-28a（＋）-CAbacteriallysates；4：PrecipitatesfrompET-28a（＋）-CAbacteriallysates；5：RecombinantproteinrHis-CAinducedwithIPTGfor4h；6：RecombinantproteinfrompET-28a（＋）-CAwithoutinduction12M3456116.0ku66.2ku45.0ku35.0ku25.0ku18.4ku28ku565

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