【摘要】：布魯氏菌�。˙rucellosis，簡(jiǎn)稱布�。┦怯刹剪斒暇鷮�(Brucella)的布魯氏菌侵入機(jī)體后引起的以流產(chǎn)、發(fā)熱、多汗、骨關(guān)節(jié)痛等為主要特征的傳染-變態(tài)反應(yīng)性人獸共患細(xì)菌病。布魯氏菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，其胞內(nèi)生存機(jī)制目前尚不十分清楚。布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)形成復(fù)制性菌泡是其在胞內(nèi)生存和增殖的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)布魯氏菌能夠通過(guò)分泌效應(yīng)蛋白募集宿主細(xì)胞的小G蛋白來(lái)調(diào)節(jié)復(fù)制性菌泡的形成，然而具體的效應(yīng)蛋白卻未可知。 Rab是小G蛋白超家族中最大的一個(gè)旁支，被認(rèn)為是信號(hào)調(diào)控的分子開關(guān)，能夠調(diào)節(jié)囊泡的形成、�？亢娃D(zhuǎn)移。前期的實(shí)驗(yàn)表明Rab1A在布魯氏菌胞內(nèi)寄生中扮演著關(guān)鍵作用。因此我們選擇Rab1A作為誘餌蛋白尋找能夠調(diào)控布魯氏菌BCV形成的效應(yīng)蛋白。本課題通過(guò)分子生物學(xué)手段構(gòu)建沉默Rab1A的慢病毒載體；重組的慢病毒質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞包裝慢病毒，轉(zhuǎn)染48h后觀察綠色熒光驗(yàn)證病毒包裝是否成功。將包裝好的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)J774A.1細(xì)胞，Western blot檢測(cè)Rab1A的表達(dá)；CFU實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)牛種布魯氏菌2308在沉默Rab1A基因的J774A.1細(xì)胞中的存活數(shù)量。利用基因克隆方法構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-4T-1-Rab1A以及兩個(gè)點(diǎn)突變復(fù)合體pGEX-4T-1-Rab1A[S25N]和pGEX-4T-1-Rab1A[Q70L]；然后IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)，使用瓊脂糖親和介質(zhì)分離純化融合蛋白；最后將純化的融合蛋白和超聲破碎的布魯氏菌上清互作，利用SDS-PAGE電泳和銀染確定差異蛋白，質(zhì)譜分析篩選出效應(yīng)蛋白。通過(guò)免疫共沉淀與免疫熒光實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證Rab1A與篩選出的布魯氏菌效應(yīng)蛋白之間存在相互作用。 DNA測(cè)序表明沉默Rab1A重組慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功；慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后熒光顯微鏡下觀察發(fā)綠色熒光，表明沉默Rab1A重組慢病毒包裝成功；Western blot證明感染該重組慢病毒的巨噬細(xì)胞其胞內(nèi)Rab1A蛋白表達(dá)明顯降低。CFU結(jié)果表明布魯氏菌感染沉默Rab1A的J774A.1細(xì)胞后胞內(nèi)存活數(shù)量顯著降低。通過(guò)GST Pull-down、質(zhì)譜及相關(guān)生物信息學(xué)分析找到與Rab1A互作的效應(yīng)蛋白HSP70；免疫共沉淀與免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明與Rab1A互作的布魯氏菌效應(yīng)蛋白是HSP70。 綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宿主細(xì)胞的小G蛋白R(shí)ab1A調(diào)節(jié)布魯氏菌在胞內(nèi)的生存，其可能的機(jī)制是通過(guò)募集布魯氏菌效應(yīng)蛋白HSP70來(lái)實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)的完成為未來(lái)進(jìn)一步探索Rab1A是否通過(guò)HSP70調(diào)節(jié)布魯氏菌BCV形成，從而調(diào)控布魯氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。效應(yīng)蛋白HSP70的發(fā)現(xiàn)也可能為布病的治療提供潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1 BCV 胞內(nèi)形成的模式[43]機(jī)體后能夠激活機(jī)體的天然免疫，此時(shí)進(jìn)入到宿菌都將會(huì)被殺死，只有少數(shù)的布魯氏菌存活下來(lái)反應(yīng)，開始在宿主細(xì)胞內(nèi)生存。因?yàn)椴剪斒暇醯募ぐl(fā)天然免疫或者逃避天然免疫的監(jiān)視，細(xì)要。布魯氏菌侵入機(jī)體后會(huì)經(jīng)歷潛伏期、急性期持續(xù)性的慢性感染期后將會(huì)對(duì)布病的治療產(chǎn)生很菌的胞內(nèi)機(jī)制將會(huì)對(duì)布病的防控和治療上起到關(guān)鍵

也可以是來(lái)源于侵入機(jī)體的細(xì)菌分泌的蛋白，如軍團(tuán)菌的 SidM[54]。圖 2 小 G蛋白活性調(diào)節(jié)模式圖2 Rab 蛋白的功能細(xì)胞內(nèi)囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)是一種可以沿著許多途徑的高度有序的定向運(yùn)輸，它起始于工體囊泡的出芽，終止于受體囊泡的膜融合。每個(gè)途徑都有共同的步驟包括：出芽、轉(zhuǎn)運(yùn)、粘附、錨定和融合[55]。大量研究表明，Rab 蛋白能夠調(diào)節(jié)囊泡的形成、�？俊⑦\(yùn)輸和轉(zhuǎn)移，但是只有部分 Rab蛋白能夠調(diào)節(jié)囊泡的出芽。細(xì)胞內(nèi)的蛋白在供體細(xì)胞器的膜上形成包被蛋白，包被蛋白能夠調(diào)控囊泡的出芽，并誘導(dǎo)運(yùn)輸囊泡的形成。包被蛋白是可以循環(huán)利用的動(dòng)態(tài)分子，它的組裝需要小 G 蛋白來(lái)幫助完成[56]。大量研究表明，Rab1、Rab5、Rab9 可以通過(guò)與效應(yīng)蛋白的結(jié)合在囊泡的出芽階段發(fā)揮功能[57-59]。囊泡出芽完成后，通過(guò)肌動(dòng)蛋白（actin）和微管細(xì)胞骨架（microtubule cytoskeleton）兩種途徑來(lái)運(yùn)輸。研究表明 Rab 可通過(guò)與馬達(dá)分子相互作用調(diào)控囊泡的運(yùn)輸[60]，目前已經(jīng)證實(shí) Rab3、Rab4、Rab5、Rab6、Rab8 可以通過(guò)與激動(dòng)纖維和微管蛋白互作來(lái)調(diào)控囊泡的運(yùn)輸[61-64]。其中 Rab6 是通過(guò)與其效應(yīng)蛋白 Rab 驅(qū)動(dòng)蛋白 6（Rabkinesin 6）互作并通過(guò)細(xì)胞骨架來(lái)指導(dǎo)完成囊泡的運(yùn)輸。囊泡的粘附是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 崔桂梅;魏盼;趙玉璽;潘壘昌;徐曉晗;彭其勝;;與Rab2互作布魯菌株效應(yīng)蛋白HSP70的鑒定[J];揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2014年02期

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本文編號(hào)：2584725