【摘要】：為了探索略陽烏雞α干擾素在大腸桿菌中高效表達(dá)的誘導(dǎo)條件,試驗(yàn)采用PCR獲得略陽烏雞α干擾素成熟肽段的編碼區(qū)DNA序列,將其克隆至載體p ET-32a的HindⅢ和XhoⅠ位點(diǎn)間,并通過菌落PCR和測序鑒定獲得的雞α干擾素的原核表達(dá)載體p ET-32a-Ch IFN-α。將p ET-32a-Ch IFN-α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta菌株,通過篩選獲得陽性克隆,進(jìn)而分別對誘導(dǎo)表達(dá)時間、誘導(dǎo)劑濃度等條件進(jìn)行篩選,獲得了略陽烏雞α干擾素的最佳表達(dá)條件。結(jié)果表明:成功構(gòu)建p ET32aCh IFN-α質(zhì)粒和重組菌株,最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為誘導(dǎo)溫度37℃,誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.2 mmol/L,誘導(dǎo)時間5 h,誘導(dǎo)時機(jī)OD600值為0.448時。說明構(gòu)建略陽烏雞α干擾素的原核表達(dá)菌株成功,并且實(shí)現(xiàn)了α干擾素的高效表達(dá)。
【圖文】：

不影響氨基酸組成，，表明成功構(gòu)建了重組pET32a－ChIFN－α質(zhì)粒。經(jīng)CAI對其密碼子分析，其中的一個突變在E．coliＲosetta中有利于雞α干擾素表達(dá)。M．DL－2000Marker;1～3．基因組DNA。圖1雞的基因組DNA檢測結(jié)果Fig．1DetectionresultofchickengenomicDNAM．DL－2000Marker;1．雞α干擾素。圖2雞α干擾素亞克隆的擴(kuò)增結(jié)果Fig．2IdentificationresultofChIFN－αsubcloningM．DL－2000Marker;1～9．陽性克隆菌落;白色箭頭．目標(biāo)蛋白。圖3菌落PCＲFig．3ColonyPCＲ3．3重組菌株原核表達(dá)條件的優(yōu)化及其檢測結(jié)果3．3．1不同IPTG濃度對雞α干擾素表達(dá)的影響SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測結(jié)果見圖5，灰度分析結(jié)果見圖6和圖7。當(dāng)加入IPTG后，目標(biāo)蛋白表達(dá)量迅速增加，IPTG的濃度對于目標(biāo)蛋白的表達(dá)存在一定的影響，當(dāng)IPTG濃度為0．2mmol/L時，目標(biāo)蛋白含量最高，其相對表達(dá)含量為53387．0550;目標(biāo)蛋白/總蛋白為0．2586，達(dá)到最高表達(dá)水平。因此認(rèn)為0．2mmol/L為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。3．3．2不同誘導(dǎo)時機(jī)對雞α干擾素的表達(dá)的影響注:下畫線部分是突變位點(diǎn)。圖4陽性克隆測序Fig．4SequencingresultsofpositiveclonesM．低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn);1．Ｒosetta未誘導(dǎo);2．Ｒosetta誘導(dǎo)5h;3．Ｒosetta/pET32a未誘導(dǎo);4．Ｒosetta/pET32a誘導(dǎo)5h;5．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α未誘導(dǎo);6～11．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α誘導(dǎo)5h(IPTG濃度為0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2mmol/L);白色箭頭．目標(biāo)蛋白。圖5重組菌株Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下的SDS－PAGE分析Fig．5SDS－PAGEanalysisofrecombinantＲosetta/pET32a－ChIFN－αinducedunderdifferentIPTGconcentrationsSDS聚丙烯酰胺凝膠檢測結(jié)果見圖8，灰度分析結(jié)果見圖9和圖10

不影響氨基酸組成，表明成功構(gòu)建了重組pET32a－ChIFN－α質(zhì)粒。經(jīng)CAI對其密碼子分析，其中的一個突變在E．coliＲosetta中有利于雞α干擾素表達(dá)。M．DL－2000Marker;1～3．基因組DNA。圖1雞的基因組DNA檢測結(jié)果Fig．1DetectionresultofchickengenomicDNAM．DL－2000Marker;1．雞α干擾素。圖2雞α干擾素亞克隆的擴(kuò)增結(jié)果Fig．2IdentificationresultofChIFN－αsubcloningM．DL－2000Marker;1～9．陽性克隆菌落;白色箭頭．目標(biāo)蛋白。圖3菌落PCＲFig．3ColonyPCＲ3．3重組菌株原核表達(dá)條件的優(yōu)化及其檢測結(jié)果3．3．1不同IPTG濃度對雞α干擾素表達(dá)的影響SDS聚丙烯酰胺凝膠檢測結(jié)果見圖5，灰度分析結(jié)果見圖6和圖7。當(dāng)加入IPTG后，目標(biāo)蛋白表達(dá)量迅速增加，IPTG的濃度對于目標(biāo)蛋白的表達(dá)存在一定的影響，當(dāng)IPTG濃度為0．2mmol/L時，目標(biāo)蛋白含量最高，其相對表達(dá)含量為53387．0550;目標(biāo)蛋白/總蛋白為0．2586，達(dá)到最高表達(dá)水平。因此認(rèn)為0．2mmol/L為最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。3．3．2不同誘導(dǎo)時機(jī)對雞α干擾素的表達(dá)的影響注:下畫線部分是突變位點(diǎn)。圖4陽性克隆測序Fig．4SequencingresultsofpositiveclonesM．低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn);1．Ｒosetta未誘導(dǎo);2．Ｒosetta誘導(dǎo)5h;3．Ｒosetta/pET32a未誘導(dǎo);4．Ｒosetta/pET32a誘導(dǎo)5h;5．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α未誘導(dǎo);6～11．Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α誘導(dǎo)5h(IPTG濃度為0．2，0．4，0．6，0．8，1．0，1．2mmol/L);白色箭頭．目標(biāo)蛋白。圖5重組菌株Ｒosetta/pET32a－ChIFN－α在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下的SDS－PAGE分析Fig．5SDS－PAGEanalysisofrecombinantＲosetta/pET32a－ChIFN－αinducedunderdifferentIPTGconcentrationsSDS聚丙烯酰胺凝膠檢測結(jié)果見圖8，灰度分析結(jié)果見圖9和圖10

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本文編號：2584410