【摘要】：蓖麻毒素(ricin toxin,RT)是大戟科蓖麻屬植物——蓖麻(ricin)分離出的毒素蛋白。它由A、B兩條鏈組成。其中,A鏈能夠與真核細(xì)胞核糖體28S r RNA腺苷殘基(A4324)高度特異性結(jié)合,發(fā)生脫嘌呤作用,形成次黃嘌呤-蓖麻毒素環(huán)(sarcin-ricin loop,SRL),抑制蛋白質(zhì)合成,發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素能夠引起細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而氧化應(yīng)激和炎癥的過(guò)程又會(huì)引起細(xì)胞自噬的發(fā)生。自噬是真核細(xì)胞高度保守的一種生存機(jī)制。它能夠通過(guò)選擇性或非選擇性降解細(xì)胞蛋白、細(xì)胞器或病原微生物,并將降解后的產(chǎn)物再利用,從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。自噬的標(biāo)志性物質(zhì)是表面附有LC3蛋白的自噬體的形成。自噬體是一種雙層膜結(jié)構(gòu),能夠包裹及運(yùn)輸待降解物質(zhì)的小囊泡,常在細(xì)胞受刺激后15-30min內(nèi)即可被檢測(cè)。自噬根據(jù)發(fā)生過(guò)程的不同又可分為三類,即大自噬、微自噬、分子伴侶介導(dǎo)自噬。“細(xì)胞自噬”通常都指大自噬。大自噬的發(fā)生過(guò)程包括誘導(dǎo)、形成、運(yùn)輸和融合、降解四個(gè)階段。當(dāng)細(xì)胞受到有害刺激,多種信號(hào)通路交互作用激活自噬信號(hào)通路,激活Beclin-1形成自噬泡即為誘導(dǎo)階段。隨后自噬相關(guān)蛋白LC3 I在Atg7的作用下向LC3 II轉(zhuǎn)化,經(jīng)Atg5-Atg12引導(dǎo)從而附著在自噬泡上。自噬泡延伸拓展,選擇性或非選擇性地將待降解物包裹形成自噬體,即為形成階段。自噬體通過(guò)多種蛋白的協(xié)同定位作用可與吞噬體融,并最終與溶酶體進(jìn)行融合,形成自噬溶酶體,即運(yùn)輸融合階段。自噬溶酶體將待降解物通過(guò)酶促反應(yīng)進(jìn)行降解。隨后自噬溶酶體裂解,并被其他細(xì)胞器再回收利用,完成降解階段。Toll樣受體屬于模式識(shí)別受體,有13個(gè)家族成員,人類有10個(gè)(TLR1-10),而小鼠有12個(gè)(TLR1-9,TLR11-13)。根據(jù)接頭蛋白的不同,可以將Toll樣受體信號(hào)通路分為My D88信號(hào)通路和TRIF信號(hào)通路。TLR4的My D88信號(hào)通路是在TLR4被激活后,My D88與IRAK形成Myddosome復(fù)合體。隨后IRAK1從My D88上分離,催化TRAF6發(fā)生聚泛素化。TRAF6與UBC13、UEV1A共同作用下,催化TAK1的聚泛素化,從而激活MAPK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生。而TLR4的IRAK信號(hào)通路需要TRAM進(jìn)行受體蛋白分選,再經(jīng)過(guò)TRIF自身低聚化而激活,使得TRAF6和TRAF3發(fā)生聚泛素化,并進(jìn)一步募集IKKε和TBK1,引起IRF3磷酸化,最終引起I型IFN基因表達(dá)。Toll樣受體信號(hào)通路與自噬信號(hào)通路之間存在交互作用。Toll樣受體信號(hào)通路的活化能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,而自噬又能通過(guò)激活酶活性或調(diào)控細(xì)胞因子分泌反饋性調(diào)控Toll樣受體信號(hào)通路。已經(jīng)證實(shí)TLR4的下游My D88、TRIF、TAK1等接頭蛋白能與Beclin 1、Bcl-2共同調(diào)節(jié)自噬信號(hào)通路。Atg5作為巨自噬和微自噬的必要的基因標(biāo)志,在自噬過(guò)程中起到重要作用。目前,對(duì)蓖麻毒素作用機(jī)制的研究主要圍繞凋亡,未見(jiàn)自噬相關(guān)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蓖麻毒素能夠激活巨噬細(xì)胞TLR4信號(hào)通路。本研究以探索Atg5在TLR4介導(dǎo)蓖麻毒素?fù)p傷中的作用機(jī)制為目的,以期為蓖麻毒素的功能開(kāi)發(fā)及中毒救治提供新的參考思路。本課題包括以下方面:(1)蓖麻毒素誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞自噬的作用本課題測(cè)量了蓖麻毒素對(duì)RAW 264.7的IC50約為100 ng/m L,確定使用十分之一IC50即10 ng/m L的蓖麻毒素為自噬誘導(dǎo)劑量,并通過(guò)Western blot方法檢測(cè)該劑量誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞自噬的通量,最終確定蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的條件:細(xì)胞密度2.5×105個(gè)/m L的RAW 264.7細(xì)胞,10 ng/m L蓖麻毒素誘導(dǎo)2 h。(2)蓖麻毒素對(duì)Atg5基因表達(dá)的影響通過(guò)用蓖麻毒素處理RAW 264.7,本課題通過(guò)PCR對(duì)Atg5蛋白進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)后,Atg5表達(dá)量增高,變化規(guī)律與LC3正相關(guān),2 h為峰值。(3)Atg5對(duì)蓖麻毒素激活TLR4信號(hào)通路的影響本課題通過(guò)將psi RNA-m Atg5質(zhì)粒和psi RNA-Luc GL3對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入RAW 264.7,通過(guò)抗生素篩選,建立了Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系和對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)PCR和Western blot驗(yàn)證,Atg5基因沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系A(chǔ)tg5的基因沉默率約為49.4%,蛋白沉默率約為89.7%。本課題通過(guò)Western blot對(duì)蓖麻毒素誘導(dǎo)RAW 264.7自噬后的TLR4信號(hào)通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并與正常RAW 264.7細(xì)胞相比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)后TLR4、My D88蛋白的表達(dá)量明顯增高,TRIF蛋白的表達(dá)量變化不明顯。這說(shuō)明蓖麻毒素能夠激活TLR4信號(hào)通路,并且激活TLR4信號(hào)通路下游My D88信號(hào)通路,而對(duì)TRIF信號(hào)通路無(wú)影響�；贏tg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,通過(guò)Western blot對(duì)Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的TLR4信號(hào)通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并與正常RAW 264.7細(xì)胞相比較。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),基因沉默Atg5后,TLR4、My D88、TRIF蛋白的表達(dá)量均提高。通過(guò)對(duì)Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬后,進(jìn)行Western blot檢測(cè)TLR4信號(hào)通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達(dá)量變化。發(fā)現(xiàn)此時(shí)的蛋白變化并無(wú)規(guī)律性。其中,TLR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白無(wú)明顯變化。并且,同樣用蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬,Atg5基因沉默的細(xì)胞與正常細(xì)胞相比,在TLR4信號(hào)通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達(dá)量變化上也呈現(xiàn)出無(wú)規(guī)律性。其中TLR4和My D88蛋白略有降低而,TRIF蛋白則顯著增高。鑒于已有文獻(xiàn)報(bào)道自噬能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生及ROS的活性,綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果、自噬的作用及蓖麻毒素本身的毒理作用,對(duì)Atg5基因沉默經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬后TLR4相關(guān)蛋白表達(dá)的無(wú)規(guī)律性進(jìn)行解釋:Atg5能夠反饋性抑制TLR4的活性。故基因敲除Atg5后TLR4相關(guān)蛋白表達(dá)均增高。當(dāng)蓖麻毒素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后,TLR4相關(guān)蛋白的表達(dá)應(yīng)該增高。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果為T(mén)LR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白無(wú)明顯變化。這可能是由于蓖麻毒素對(duì)蛋白質(zhì)合成抑制起主導(dǎo)作用,而基因敲除Atg5對(duì)TLR4信號(hào)通路的活性增強(qiáng)作用更弱。該推論也能解釋經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬的Atg5基因沉默細(xì)胞較經(jīng)蓖麻毒素誘導(dǎo)自噬的正常細(xì)胞,TLR4和My D88表達(dá)量略有降低。但TRIF蛋白表達(dá)量明顯增高,則可能存在其他信號(hào)通路對(duì)TRIF的表達(dá)進(jìn)行影響,但仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。本課題得出結(jié)論:(1)對(duì)于細(xì)胞密度2.5×105個(gè)/m L的RAW 264.7細(xì)胞,使用10 ng/m L蓖麻毒素誘導(dǎo)2 h,引起自噬通量最大,且存在劑量依賴性。(2)Atg5的表達(dá)與蓖麻毒素引起的自噬通量正相關(guān)。(3)Atg5能夠通過(guò)抑制TLR4信號(hào)通路,抑制炎癥反應(yīng)。
【圖文】：

ern blot 結(jié)果如圖 2 所示。Rapamycin 陽(yáng)性組和 EBSS 陽(yáng)性組 LC3 II于對(duì)照組，差異極顯著。10 ng/mL RT 處理 RAW 264.7 細(xì)胞：1 h表達(dá)量已明顯高于對(duì)照組，差異極顯著；2 h 時(shí)，LC3 II 的表達(dá)量比對(duì)照組差異極顯著；4 h 時(shí)，，LC3 II 的表達(dá)量降低，略高于對(duì)照。則對(duì)于細(xì)胞密度 2.5×105個(gè)/mL 的 RAW 264.7 細(xì)胞，10 ng/mL 起 LC3 增高最多，即自噬通量最大。

264.7 經(jīng)蓖麻毒素處理不同時(shí)間后 LC3 表達(dá)水平變化 Weste果使用正常 RAW264.7 細(xì)胞。EBSS 組用 EARLES BALANCED SALT Srapamycin 組用 rapamycin 處理細(xì)胞 2 小時(shí)。RT-1 h 組用 10 ng/mL h 組用 10 ng/mL 蓖麻毒素處理 2 h。RT-4 h 組用 10 ng/mL 蓖麻毒素平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差。*表示與 Control 組比較 0.01<p<0.05；**表示與對(duì) Atg5 基因表達(dá)的影響、RT 2 h 組、RT 4 h 組、對(duì)照組 Atg5 基因表達(dá)情況的 PC結(jié)果如圖 3 所示。RAW 264.7 細(xì)胞經(jīng) 10 ng/mL 蓖麻毒素
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S859.8

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1 劉林娜;董穎;李吉平;劉文森;萬(wàn)家余;孫玉成;高宏偉;;蓖麻毒素誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞的凋亡[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2009年02期

2 劉林娜;董t

本文編號(hào)：2582545