【摘要】：蓖麻毒素(ricin toxin,RT)是大戟科蓖麻屬植物——蓖麻(ricin)分離出的毒素蛋白。它由A、B兩條鏈組成。其中,A鏈能夠與真核細胞核糖體28S r RNA腺苷殘基(A4324)高度特異性結合,發(fā)生脫嘌呤作用,形成次黃嘌呤-蓖麻毒素環(huán)(sarcin-ricin loop,SRL),抑制蛋白質合成,發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素能夠引起細胞發(fā)生氧化應激和炎癥反應,并進一步誘導細胞凋亡。而氧化應激和炎癥的過程又會引起細胞自噬的發(fā)生。自噬是真核細胞高度保守的一種生存機制。它能夠通過選擇性或非選擇性降解細胞蛋白、細胞器或病原微生物,并將降解后的產物再利用,從而起到保護細胞的作用。自噬的標志性物質是表面附有LC3蛋白的自噬體的形成。自噬體是一種雙層膜結構,能夠包裹及運輸待降解物質的小囊泡,常在細胞受刺激后15-30min內即可被檢測。自噬根據發(fā)生過程的不同又可分為三類,即大自噬、微自噬、分子伴侶介導自噬�！凹毎允伞蓖ǔ６贾复笞允伞４笞允傻陌l(fā)生過程包括誘導、形成、運輸和融合、降解四個階段。當細胞受到有害刺激,多種信號通路交互作用激活自噬信號通路,激活Beclin-1形成自噬泡即為誘導階段。隨后自噬相關蛋白LC3 I在Atg7的作用下向LC3 II轉化,經Atg5-Atg12引導從而附著在自噬泡上。自噬泡延伸拓展,選擇性或非選擇性地將待降解物包裹形成自噬體,即為形成階段。自噬體通過多種蛋白的協同定位作用可與吞噬體融,并最終與溶酶體進行融合,形成自噬溶酶體,即運輸融合階段。自噬溶酶體將待降解物通過酶促反應進行降解。隨后自噬溶酶體裂解,并被其他細胞器再回收利用,完成降解階段。Toll樣受體屬于模式識別受體,有13個家族成員,人類有10個(TLR1-10),而小鼠有12個(TLR1-9,TLR11-13)。根據接頭蛋白的不同,可以將Toll樣受體信號通路分為My D88信號通路和TRIF信號通路。TLR4的My D88信號通路是在TLR4被激活后,My D88與IRAK形成Myddosome復合體。隨后IRAK1從My D88上分離,催化TRAF6發(fā)生聚泛素化。TRAF6與UBC13、UEV1A共同作用下,催化TAK1的聚泛素化,從而激活MAPK信號通路和NF-κB信號通路,誘導炎癥因子的產生。而TLR4的IRAK信號通路需要TRAM進行受體蛋白分選,再經過TRIF自身低聚化而激活,使得TRAF6和TRAF3發(fā)生聚泛素化,并進一步募集IKKε和TBK1,引起IRF3磷酸化,最終引起I型IFN基因表達。Toll樣受體信號通路與自噬信號通路之間存在交互作用。Toll樣受體信號通路的活化能夠誘導自噬的發(fā)生,而自噬又能通過激活酶活性或調控細胞因子分泌反饋性調控Toll樣受體信號通路。已經證實TLR4的下游My D88、TRIF、TAK1等接頭蛋白能與Beclin 1、Bcl-2共同調節(jié)自噬信號通路。Atg5作為巨自噬和微自噬的必要的基因標志,在自噬過程中起到重要作用。目前,對蓖麻毒素作用機制的研究主要圍繞凋亡,未見自噬相關報道。本課題組前期研究發(fā)現蓖麻毒素能夠激活巨噬細胞TLR4信號通路。本研究以探索Atg5在TLR4介導蓖麻毒素損傷中的作用機制為目的,以期為蓖麻毒素的功能開發(fā)及中毒救治提供新的參考思路。本課題包括以下方面:(1)蓖麻毒素誘導RAW 264.7細胞自噬的作用本課題測量了蓖麻毒素對RAW 264.7的IC50約為100 ng/m L,確定使用十分之一IC50即10 ng/m L的蓖麻毒素為自噬誘導劑量,并通過Western blot方法檢測該劑量誘導不同時間細胞自噬的通量,最終確定蓖麻毒素誘導細胞自噬的條件:細胞密度2.5×105個/m L的RAW 264.7細胞,10 ng/m L蓖麻毒素誘導2 h。(2)蓖麻毒素對Atg5基因表達的影響通過用蓖麻毒素處理RAW 264.7,本課題通過PCR對Atg5蛋白進行檢測。實驗發(fā)現,經蓖麻毒素誘導后,Atg5表達量增高,變化規(guī)律與LC3正相關,2 h為峰值。(3)Atg5對蓖麻毒素激活TLR4信號通路的影響本課題通過將psi RNA-m Atg5質粒和psi RNA-Luc GL3對照質粒轉染進入RAW 264.7,通過抗生素篩選,建立了Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉細胞系和對照質粒穩(wěn)轉細胞系。經過PCR和Western blot驗證,Atg5基因沉默的穩(wěn)轉細胞系Atg5的基因沉默率約為49.4%,蛋白沉默率約為89.7%。本課題通過Western blot對蓖麻毒素誘導RAW 264.7自噬后的TLR4信號通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達量進行檢測,并與正常RAW 264.7細胞相比較。實驗發(fā)現,經蓖麻毒素誘導后TLR4、My D88蛋白的表達量明顯增高,TRIF蛋白的表達量變化不明顯。這說明蓖麻毒素能夠激活TLR4信號通路,并且激活TLR4信號通路下游My D88信號通路,而對TRIF信號通路無影響�；贏tg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉細胞系,通過Western blot對Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉細胞系的TLR4信號通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達量進行檢測,并與正常RAW 264.7細胞相比較。實驗發(fā)現,基因沉默Atg5后,TLR4、My D88、TRIF蛋白的表達量均提高。通過對Atg5基因沉默的RAW 264.7穩(wěn)轉細胞系經蓖麻毒素誘導自噬后,進行Western blot檢測TLR4信號通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達量變化。發(fā)現此時的蛋白變化并無規(guī)律性。其中,TLR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白無明顯變化。并且,同樣用蓖麻毒素誘導自噬,Atg5基因沉默的細胞與正常細胞相比,在TLR4信號通路TLR4、My D88、TRIF蛋白表達量變化上也呈現出無規(guī)律性。其中TLR4和My D88蛋白略有降低而,TRIF蛋白則顯著增高。鑒于已有文獻報道自噬能夠抑制炎癥因子的產生及ROS的活性,綜合考慮實驗結果、自噬的作用及蓖麻毒素本身的毒理作用,對Atg5基因沉默經蓖麻毒素誘導自噬后TLR4相關蛋白表達的無規(guī)律性進行解釋:Atg5能夠反饋性抑制TLR4的活性。故基因敲除Atg5后TLR4相關蛋白表達均增高。當蓖麻毒素誘導細胞自噬后,TLR4相關蛋白的表達應該增高。而實驗結果為TLR4蛋白略有降低而My D88、TRIF蛋白無明顯變化。這可能是由于蓖麻毒素對蛋白質合成抑制起主導作用,而基因敲除Atg5對TLR4信號通路的活性增強作用更弱。該推論也能解釋經蓖麻毒素誘導自噬的Atg5基因沉默細胞較經蓖麻毒素誘導自噬的正常細胞,TLR4和My D88表達量略有降低。但TRIF蛋白表達量明顯增高,則可能存在其他信號通路對TRIF的表達進行影響,但仍需要進一步實驗證明。本課題得出結論:(1)對于細胞密度2.5×105個/m L的RAW 264.7細胞,使用10 ng/m L蓖麻毒素誘導2 h,引起自噬通量最大,且存在劑量依賴性。(2)Atg5的表達與蓖麻毒素引起的自噬通量正相關。(3)Atg5能夠通過抑制TLR4信號通路,抑制炎癥反應。
【圖文】：

ern blot 結果如圖 2 所示。Rapamycin 陽性組和 EBSS 陽性組 LC3 II于對照組，差異極顯著。10 ng/mL RT 處理 RAW 264.7 細胞：1 h表達量已明顯高于對照組，差異極顯著；2 h 時，LC3 II 的表達量比對照組差異極顯著；4 h 時，，LC3 II 的表達量降低，略高于對照。則對于細胞密度 2.5×105個/mL 的 RAW 264.7 細胞，10 ng/mL 起 LC3 增高最多，即自噬通量最大。

264.7 經蓖麻毒素處理不同時間后 LC3 表達水平變化 Weste果使用正常 RAW264.7 細胞。EBSS 組用 EARLES BALANCED SALT Srapamycin 組用 rapamycin 處理細胞 2 小時。RT-1 h 組用 10 ng/mL h 組用 10 ng/mL 蓖麻毒素處理 2 h。RT-4 h 組用 10 ng/mL 蓖麻毒素平均數±標準誤差。*表示與 Control 組比較 0.01<p<0.05；**表示與對 Atg5 基因表達的影響、RT 2 h 組、RT 4 h 組、對照組 Atg5 基因表達情況的 PC結果如圖 3 所示。RAW 264.7 細胞經 10 ng/mL 蓖麻毒素
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S859.8

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1 劉林娜;董穎;李吉平;劉文森;萬家余;孫玉成;高宏偉;;蓖麻毒素誘導的小鼠淋巴細胞的凋亡[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年02期

2 劉林娜;董t

本文編號：2582545