【摘要】：布魯氏菌病(Brucellosis)由布魯氏菌引起的動物源性的人畜共患傳染病。布魯氏菌能進入機體并在機體內生存繁殖,逃避機體的免疫系統(tǒng),機體固有免疫和適應性免疫通過抗感染免疫來監(jiān)測、防御并清除入侵的病原體。病原體逃避宿主免疫大體上有三種途徑,即隱匿、誘變和抑制。隱匿是指布魯氏菌可能隱匿于自噬體中,干擾自噬體與溶酶體的融合,從而逃避宿主細胞的殺傷;誘變是指病原體通過改變自身的抗原特性,從而逃逸業(yè)已誘生的免疫應答的作用;抑制是指布魯氏菌可抑制宿主細胞凋亡,避免在細胞死亡后被機體的體液免疫和細胞免疫清除,從而保護其在宿主細胞內的長期寄生,并造成持續(xù)性感染。IV型分泌系統(tǒng)(Type IV secretion systems,T4SS)是布魯氏菌重要的毒力因子之一,它在布魯氏菌感染的過程中可以將分泌蛋白轉移到宿主細胞中,幫助其入侵和定殖,而這其中的機制還不完全清楚。本文主要研究T4SS分泌蛋白在布魯氏菌感染過程中對細胞自噬和凋亡的影響。主要開展的研究工作如下:(1)構建流產(chǎn)布魯氏菌2308(S2308)的VceA和VceC基因缺失突變株。分別擴增基因上下游同源臂和卡那基因,運用融合PCR融合三段基因并連接PMD18-T,同源重組的原理互換親本株基因組中的目標基因,檢測其生長特性,用兩個缺失株分別侵染胚胎滋養(yǎng)層細胞(HPT-8)和感染小母鼠并檢測其在胞內存活情況。結果顯示成功構建缺失株ΔVceA和ΔVceC且穩(wěn)定的傳至少10代,生長趨勢均在12 h達到對數(shù)生長期,30h進入平臺期和親本株無差異,在HPT-8細胞和小鼠脾臟中的存活能力顯著低于親本株S2308。(2)表達并純化布魯氏菌VceA和VceC蛋白,并分析其對細胞的影響。構建分泌蛋白VceA和VceC基因的原核表達載體,純化后得到其重組蛋白。鑒定其反應原性,檢測蛋白作用于細胞后細胞因子的表達量。結果顯示成功構建VceA和VceC原核表達載體,純化的蛋白Western blot檢測出現(xiàn)雜交條帶,具有很好的反應原性,VceA蛋白作用于細胞后TNF-α,IL-1β,TGF-β1的分泌量均顯著升高,VceC作用的細胞IL-18,TNF-α和TGF-β1的分泌量顯著降低。(3)初步探討VceA和VceC基因對細胞自噬的影響。檢測自噬相關基因ATG5,p62,LC3的m RNA表達量;Western blot,共聚焦顯微鏡和小鼠子宮免疫組化檢測p62蛋白的表達量,透射電鏡檢測自噬小體。結果顯示ΔVceA侵染細胞后p62基因的表達顯著低于S2308組,ΔVceC感染小鼠1 d和7 d時均顯著高于S2308組,VceC蛋白則無差異;ATG5的表達中ΔVceA在侵染細胞3h,24 h和感染小鼠1 d和56 d均顯著高于S2308組,ΔVceC在侵染24 h和感染28d顯著低于S2308,VceA蛋白則是3 h和12 h顯著低于NC組,VceC蛋白無顯著性差別;LC3-II/LC3-I的比值中ΔVceA在侵染細胞12 h,24 h和感染小鼠1 d,7 d時均顯著高于S2308,而ΔVceC在侵染細胞后顯著低于S2308組。WB實驗顯示ΔVceA組的p62蛋白在侵染細胞時無顯著性變化,在小鼠子宮中顯著低于S2308組,ΔVceC組比對照組高,VceA蛋白作用細胞后顯著高于NC組;ΔVceA組ATG5蛋白的表達高于S2308組,ΔVceC侵染組顯著低于對照組,而VceC蛋白作用組表達則高于正常組。激光共聚焦顯示ΔVceA組低于S2308組,ΔVceC高于S2308組;小鼠子宮p62的免疫組化實驗顯示在1 d,7 d和14d時ΔVceA組可見的免疫染色少于S2308組,而ΔVceC則是多于S2308組;在電鏡下ΔVceA侵染組中發(fā)現(xiàn)自噬小體。結果表明ΔVceA不同程度的促進細胞自噬的發(fā)生,VceA蛋白抑制細胞自噬;ΔVceC是不同程度的抑制細胞自噬的發(fā)生,VceC蛋白促進自噬。(4)初步探究VceA和VceC基因對細胞凋亡的影響。檢測凋亡相關基因Caspase-3,Bcl-2,Bax的m RNA表達量;Western blot檢測Caspase-3,Bcl-2和細胞內細胞色素C(Cyt-C)蛋白的表達量;流式細胞術檢測HPT-8細胞的凋亡率;激光共聚焦顯微鏡和小鼠子宮免疫組化實驗檢測Cyt-C的釋放情況。實驗結果顯示Caspase-3基因的m RNA的表達水平在侵染24 h時和小鼠感染后1 d時ΔVceA都顯著低于S2308組;Bax/Bcl-2的結果顯示侵染細胞3 h,24 h和感染小鼠7 d時ΔVceA均表現(xiàn)為小于1,ΔVceC在侵染24h和感染7 d,14d比值小于1,VceA蛋白作用組在12 h,24 h時表現(xiàn)為大于1,VceC蛋白只在24 h大于1;Caspase-3蛋白的表達和Cyt-C蛋白的表達及定位在24 h兩缺失株都低于S2308組,而Bcl-2抗凋亡蛋白的表達中兩缺失株均高于S2308組,兩蛋白均低于對照組;細胞流式術檢測中12 h只有ΔVceC低于S2308,24 h二缺失株均低于親本株;小鼠子宮免疫組化顯示兩缺失株組出現(xiàn)的免疫染色少于對照組。結果表明ΔVceA和ΔVceC都是在不同程度上抑制細胞凋亡的發(fā)生,而VceA和VceC蛋白則是促進細胞凋亡的。
【圖文】：

魯氏菌分泌蛋白 VceA和 VceC 對細胞自噬和凋亡的影響5圖1 布魯氏菌在巨噬細胞內存活的模式Figure .1 Working model of Brucella intracellular trafficking in macrophage cells2布魯氏菌與細胞自噬2.1細胞自噬的概念自噬（autophagy）是在溶酶體國際會議上由科學家 Christian de Duve 第一次提出的[16]，是細胞完成自身代謝和某些細胞器更新的過程。它發(fā)生在真核生物的細胞質中，并且是非常保守的過程，并有許多自噬相關基因參與。首先形成的雙層膜結構包裹需要被降解的底物（細胞自身蛋白質或細胞器等）成為自噬體(Autophagosome)，然后自噬體與溶酶體膜融合，需要降解的包裹物被溶酶體內的酶降解。這在調節(jié)細胞生命活動中具有重要作用[17]。細胞自噬功能的紊亂會導致許多疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、病原體感染和腫瘤發(fā)生等問題[18]。2.2細胞自噬的分類及發(fā)生由于細胞自噬過程中細胞內物質運送到溶酶體方式的差異，將其歸為三種方式，即為：巨自噬 （也叫大自噬，，macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬 （Chaperone-mediated atedautophagy

A B圖 1-1 炎性細胞因子標準曲線A：TNF-α標準曲線；B：IL-1β 標準曲線；Fig.1-1 The standard curve of Inflammatory cytokinesA: TNF-α standard curve. B: IL-1β standard curve.
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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1 袁順翎;方瑤;毛旭虎;;自噬與微生物感染[J];生命的化學;2016年05期

2 江雅麗;陳創(chuàng)夫;李志強;李默;李爽;王震;張歡;張輝;郭飛;;布魯菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應蛋白DK63-887基因缺失株的構建及鑒定[J];動物醫(yī)學進展;2016年05期

3 孫志華;張輝;劉來珍;劉娟;韓玉霞;關團;王浩;陳創(chuàng)夫;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應分子BPE123和BPE275基因的原核表達與鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版);2016年05期

4 易德武;張俊波;王遠志;李默;李爽;張歡;王杰;陳創(chuàng)夫;;羊種布魯氏菌新疆流行株015株sodc基因缺失株的構建與初步評價[J];石河子大學學報(自然科學版);2016年01期

5 權伍榮;楊詠潔;;布魯氏菌逃逸宿主的抗感染免疫機制[J];微生物學報;2016年05期

6 劉來珍;孫志華;劉娟;史靜雪;陳創(chuàng)夫;張輝;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0339基因的原核表達及免疫反應性分析[J];石河子大學學報(自然科學版);2015年06期

7 劉來珍;孫志華;劉娟;史靜雪;陳創(chuàng)夫;張輝;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI0580基因的原核表達[J];草食家畜;2015年05期

8 劉娟;孫志華;張靜;張豫;劉來珍;李明奇;張輝;;布魯氏菌感染誘發(fā)巨噬細胞炎癥反應的初步研究[J];石河子大學學報(自然科學版);2015年04期

9 劉來珍;孫志華;劉娟;史靜雪;陳創(chuàng)夫;張輝;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白BMEI1069基因的原核表達與分析[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2015年03期

10 紀太旺;張輝;郭飛;張科;李志強;王震;趙慶亮;王浩;陳創(chuàng)夫;;布魯氏菌043強毒株BR0524基因缺失突變株的構建與毒力的初步評價[J];石河子大學學報(自然科學版);2014年05期

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1 喬鳳;外膜蛋白Omp25在布魯氏菌毒力及免疫保護中的作用研究[D];吉林大學;2009年

本文編號：2576709