【摘要】：減蛋綜合征病毒(Egg drop syndrome virus,EDSV)來源于鴨,被命名為鴨腺病毒Ⅰ型,EDSV主要引起雞的產(chǎn)蛋率及蛋品質(zhì)的下降。近年來,研究表明EDSV可以導(dǎo)致雛鴨發(fā)生急性呼吸道感染,甚至出現(xiàn)死亡。目前,對人類感染腺病毒進(jìn)行了廣泛的研究,但是對于禽類感染EDSV的機(jī)制研究較少。在本研究中,EDSV及其Hexon蛋白均可以誘導(dǎo)鴨胚胎成纖維細(xì)胞(Duck embryonic fibroblast,DEF)發(fā)生細(xì)胞凋亡,從而為研究該病毒對禽類的致病機(jī)理提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)及科學(xué)依據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果如下:1.將EDSV接種DEF單層細(xì)胞后檢測細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)及病毒增殖水平。結(jié)果表明,EDSV感染DEF細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變,隨著感染時(shí)間延長,細(xì)胞界限不清楚,貼附性降低,細(xì)胞漂浮增多。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測EDSV在DEF細(xì)胞中的增殖規(guī)律表明:病毒水平在感染后24 h~60 h持續(xù)增殖。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒血凝效價(jià)檢測表明,隨著感染時(shí)間的增加,病毒血凝效價(jià)從感染初期23上升至28。以上說明EDSV可以在DEF細(xì)胞上穩(wěn)定持續(xù)的增殖并引起病變效應(yīng)。2.利用流式細(xì)胞術(shù)研究EDSV誘導(dǎo)DEF細(xì)胞發(fā)生凋亡的結(jié)果表明,EDSV感染DEF細(xì)胞后24 h時(shí)凋亡率開始升高,在感染后60 h時(shí)凋亡率達(dá)到29.1%,差異顯著(P0.05)。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目在感染36 h~60 h時(shí)顯著增加。利用Caspase活性實(shí)驗(yàn)以及Western blot法檢測表明,EDSV感染能夠激活Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9,并且上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá),下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的表達(dá),Bax/Bcl-2的比率隨感染時(shí)間延長逐漸上升且差異顯著(P0.05)。3.成功構(gòu)建EDSV Hexon蛋白的真核載體pCDNA-3.1-Hexon,轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon的DEF細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h、36 h時(shí)Hexon的表達(dá)量較高,隨后有所下降。利用TUNEL染色法發(fā)現(xiàn),DEF轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon后發(fā)生凋亡的陽性細(xì)胞的數(shù)目較對照組陽性細(xì)胞顯著升高(P0.05),并且同組轉(zhuǎn)染細(xì)胞在24 h、36 h時(shí)TUN EL陽性細(xì)胞數(shù)目較48 h、60 h時(shí)顯著升高(P0.05)。Caspase活性和Western blot檢測結(jié)果顯示DEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA-3.1-Hexon后,Caspase-8、Caspase-9及Caspase-3的活性在24 h、36 h時(shí)被激活。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)升高,Bcl-2的表達(dá)水平降低。本研究表明EDSV及其Hexon蛋白均可以誘導(dǎo)DEF細(xì)胞發(fā)生凋亡,且主要通過激活外源性途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,本研究結(jié)果為進(jìn)一步探索EDSV感染對宿主細(xì)胞的致病機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也為研究禽病病毒的致病機(jī)制提供新思路。
【圖文】：

圖 2-1 感染 EDSV 后鴨胚原代成纖維細(xì)胞的病變觀察(100×)Fig. 2-1 CPE of DEF cell after infected with EDSV (100×)2.3.3 penton 基因的 PCR 擴(kuò)增通過普通 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 EDSV penton 片段，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。如圖 2-2 所示，得到與預(yù)期片段大小相同的 151 bp 的特異性條帶，，。M：DL2000 DNA 分子量 1：陰性對照 2：EDSV 五鄰體基因擴(kuò)增產(chǎn)物

圖 2-3 q-PCR 檢測 EDSV 在 DEF 細(xì)胞上的增殖規(guī)律Fig. 2-3The proliferation of EDSV on DEF cell by q-PCR流式細(xì)胞術(shù)檢測 EDSV 感染對 DEF 細(xì)胞凋亡率的影響圖 2-4A、B 所示，與對照細(xì)胞相比，EDSV 感染 24 h 時(shí) DEF 細(xì)胞<0.05），且凋亡率隨感染時(shí)間增加；在感染后 60 h 時(shí)達(dá)到最大值（（P<0.01）。在對照細(xì)胞中沒有觀察到明顯的凋亡率變化。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2576727