【摘要】：本研究旨在利用巢式RT-PCR技術(shù),建立高效檢測小鼠諾如病毒(murine norovirus,MNV)的方法。通過Gen Bank上公布的一系列小鼠諾如病毒的基因序列,設(shè)計內(nèi)、外各一對特異性引物,通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,建立巢式RT-PCR檢測方法,并對臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,本研究建立的巢式PCR檢測方法特異性好,最低檢出量為1×102copies/L,高于使用參考引物RT-PCR的最低檢出量1×105 copies/L,對臨床樣品檢出率為73%,高于使用參考引物普通RT-PCR的檢出率(60%),與RT-qPCR方法檢出率一致。結(jié)果表明,本研究成功建立了一種檢測小鼠諾如病毒的巢式RT-PCR方法,并能快速、高效地應(yīng)用于臨床樣品的檢測,為小鼠諾如病毒的診斷和檢測提供了有力的手段。
【圖文】：

中國獸醫(yī)科學(xué)第47卷圖1巢式PCR檢測Fig.1NestedRT-PCRfordetectionofmurinenorovirusM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：引物MNV-F1和MNV-R1的擴(kuò)增產(chǎn)物；2：陰性對照；3：引物MNV-F2和MNV-R2的擴(kuò)增產(chǎn)物；4：陰性對照M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductusingprimersMNV-F1andMNV-R1；2：Negativecontro；l3：PCRproductusingprimesrMNV-F2andMNV-R2；4：NegativecontrolPlus）12.5L，cDNA2L，補ddH2O至25L。第一輪反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸36s，共25個循環(huán)。第二輪反應(yīng)體系：引物為MNV-F2（10mol/L）、MNV-R2（10mol/L）各0.2L，取第一輪PCR產(chǎn)物1L作為模板，2×TaqMasterMix（DyePlus）12.5L，補ddH2O至25L。第二輪反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸18s，共30個循環(huán)。取5LPCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-3500R）檢測結(jié)果。1.6PCR產(chǎn)物的克隆與序列分析按凝膠回收試劑盒操作說明回收、純化大小為309bp的目的片段。按照載體pMD19-T的說明書操作連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐青霉素（Ampicilli）n抗性篩選，挑取菌落進(jìn)行PCR鑒定。將陽性菌液送至英濰捷基（Invitroge）n貿(mào)易有限公司進(jìn)行測序，并在NCBI網(wǎng)站上用BLAST在線軟件進(jìn)行核苷酸同源性分析。1.7敏感性與特異性試驗巢式PCR特異性試驗：分別以小鼠肝炎病毒（mousehepatitisvir，uMsHV）、小鼠白血病病毒（murineleukemiavir，uMsLV）、鼠痘病毒（ectromeliavirus，ECTV）、小鼠仙臺病毒（Sendaiviru，sSeV）陽性核酸為模板，用步驟1.5建立的巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。巢式PCR敏感性試驗：使用NanoDrop2000超微量分光光度計測量重組質(zhì)粒pEASY-MNV-VP1核酸

感染MNV的情況。研究發(fā)現(xiàn)，MNV在體內(nèi)傾向于在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)復(fù)制［14］。人工感染MNV的野生型小鼠在感染后第24小時，，病毒從最初的小腸近端位置擴(kuò)散至肺、肝、淋巴結(jié)和脾臟；在感染后第72小時，其體內(nèi)的病毒量比感染初期提高了20倍［15］。雖然目前沒有相關(guān)研究表明感染MNV對實驗小鼠產(chǎn)生明顯的病理變化，但是由于MNV最初的復(fù)制場所位于小腸且趨向于在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，所以對于胃腸道疾病和免疫學(xué)疾病的研究者來說，要避免使用攜帶MNV的實驗小鼠。傳統(tǒng)的MNV檢測基于電鏡技術(shù)和血清學(xué)技圖3巢式PCR敏感性分析Fig.3ThesensitivitytestofthenestedPCRM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～4：分別是1×109～1×106copies/L；5～14：分別是1×109～1×100copies/L；N1、N2：陰性對照M：DL2000DNAMarker；1—4：1×109—1×106copies/L，respec-tivel；y5—14：1×109—1×100copies/L，respective；lNy1，N2：Nega-tivecontr，orlespectively1234N1MN2567891011121314604bp309bp圖2應(yīng)用參考引物進(jìn)行的普通PCR的敏感性分析Fig.2ThesensitivitytestusingthereferenceprimersM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：陰性對照；2～6：分別是1×108～1×104copies/LM：DL2000DNAMarker；1：Negativecontro；l2—6：1×108—1×104copies/L，respectivelyM1234562000bp1500bp1000bp750bp500bp200bp547bp圖4巢式PCR特異性分析Fig.4ThespecificitytestofthenestedPCR1：陰性對照，M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2：MNV；3：MHV；4：MLV；5：SeV；6：ECTV1：Negativecontro；lM：DL2000DNAMarker；2：MNV；3：MHV；4：MLV；5：SeV；6：ECTV1M234562000bp1500bp1000bp750bp

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本文編號：2576299