【摘要】：目的:為研究GBEP對NDV的作用,通過水提醇沉法提取銀杏外種皮多糖(GBEP),采用苯酚-硫酸法測定GBEP的糖含量,并用傅里葉-紅外光譜法分析其光譜特征。在此基礎(chǔ)上將不同濃度GBEP接種DF-1細胞和9-11日齡雞胚,以測定GBEP在細胞和雞胚上的安全濃度。而后比較不同給藥方式(先給藥再加入病毒,先加入病毒再給藥以及藥物和病毒混合孵育后再攻毒)對NDV的作用。此外將NDV稀釋液加入到DF-1細胞中通過在不同時間段提取細胞和病毒的總RNA,采用RT-PCR法定量分析NDV在不同時間段內(nèi)的mRNA表達量,以此解釋NDV侵染DF-1細胞的吸附、增殖和釋放特性;同時采用掃描電鏡觀察添加病毒后細胞表面的變化,以及采用間接免疫熒光實驗研究NDV在細胞內(nèi)的增殖情況。最后將不同濃度(20、10、5μg/mL)的GBEP添加到細胞感染病毒的不同時間,采用RT-PCR法定量分析藥物作用后NDV的表達量,以及免疫熒光法探究藥物對NDV在DF-1細胞中復(fù)制特性的影響。結(jié)果:GBEP的糖含量為51.9%且不含淀粉;其紅外光譜圖呈典型的多糖圖譜,在1250.6cm-1有較強吸收。GBEP在不高于50 μg/mL時對DF-1細胞生長無顯著影響,不高于4 mg/枚雞胚時不影響雞胚的正常發(fā)育�？筃DV方面,在DF-1細胞上先給藥后加病毒組,1.25μg/mLGBEP組的OD值即顯著大于攻毒對照(P0.01),與同劑量的利巴韋林組相比無顯著差異(P0.05);先加病毒后給藥組,1.25μg/mLGBEP組的OD值亦顯著大于攻毒對照組(P0.05),但不及同劑量的利巴韋林,但隨著劑量的增加其作用加強;混合作用組GBEP的各濃度組的OD值均顯著大于攻毒對照組(P0.01)與同劑量的利巴韋林組相比無顯著差異(P0.05)。在雞胚中試驗中,0.8 mg GBEP/枚組的胚體發(fā)育、HA血凝價均與利巴韋林組相近,而攻毒對照組雞胚在48 h時全部死亡。先攻毒再給GBEP組的雞胚在48 h時出現(xiàn)5枚死亡,60 h時全部死亡;先給藥再攻毒組中的雞胚在同時期出現(xiàn)1枚死亡,而GBEP與病毒混合孵育后再攻毒組未出現(xiàn)死亡,且72h的胚體長度明顯長于攻毒對照組(P0.05)。NDV在DF-1細胞上復(fù)制周期的檢測結(jié)果表明,NDV稀釋液加入到DF-1細胞后,約11Omin對細胞的吸附量達到飽和,同時在細胞表面發(fā)現(xiàn)有病毒粒子存在;病毒稀釋液添加到細胞約13h后其在細胞內(nèi)的增殖量達到最大,并呈現(xiàn)出明顯的時間效應(yīng);病毒加入到細胞6h時,細胞上清液中即可檢測到NDV,42h時NDV含量達到最大,說明病毒感染6h后即開始釋放。不同濃度的GBEP和NDV同時加入到細胞后,NDV對DF-1細胞的吸附量極顯著低于攻毒對照組(P0.01);在病毒進入細胞后再加入不同濃度的GBEP也可極顯著降低NDV在細胞內(nèi)的增殖量(P0.01);此外藥物和病毒共同孵育后再加入細胞,NDV對細胞的吸附量也極顯著低于攻毒對照組(P0.01):RT-PCR結(jié)果顯示,各加藥組的NDV-F基因的表達量都低于攻毒對照組;免疫熒光試驗結(jié)果表明,各藥物組的熒光強度都低于攻毒對照組。結(jié)論:以上結(jié)果表明GBEP是含有硫酸基團的酸性多糖,其在DF-1細胞和雞胚上均具有抑制和滅活NDV作用,在DF-1細胞上的作用要好于雞胚;此外,GBEP能夠顯著降低NDV對DF-1細胞的吸附和細胞內(nèi)增殖。
【圖文】：

２．１ＧＢＥＰ的糖含量測定逡逑根據(jù)標準曲線Ｙ＝0．１１３Ｘ＋０．４２７７，邋Ｒ２＝０．９８，將ＧＢＥＰ樣品的吸光值帶入算得ＧＢ的糖含量為５１．９％。逡逑２．２ＧＢＥＰ的淀粉含量測定逡逑其中１號試管為陰性蒸餾水試驗結(jié)果，２號試管為陽逡逑性淀粉試管實驗結(jié)果，３號試宵為ＧＢＥＰ樣品試驗結(jié)逡逑１邐３邐p}。從圖中T以Ｈ？出陽性組（淀粉tb液）樣品４碘碘逡逑化鉀反應(yīng)后呈藍黑色，１號管和３號管呈無色變化，逡逑這表明ＧＢＥＰ是不含淀粉的多糖。逡逑圖２為ＧＢＥＰ的碘碘化鉀實驗結(jié)果。逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｉｏｄｉｎｅ邋ｐｏｔａｓｓｉｕｍ邋ｉｏｄｉｄｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ邋ｍｅａｓｕｒｅ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｏｆ邋ｓｔａｒｃｈ邋ｉｎ邋ＧＢＥＰ逡逑２．３ＧＢＥＰ的紅外光譜測定結(jié)果：逡逑

釋液作陽性對照（取稀釋液之前搖晃ＥＰ管數(shù)次，稀釋液？，而后向２號試管中滴加碘－碘化鉀試劑，停止滴加，而后分別向１號和３號試管滴加同１．２．２．３紅外光譜掃描法對ＧＢＥＰ的結(jié)構(gòu)將凍干好的ＧＢＥＰ置于紅外燈下，取樣品約中，用瑪瑙研磨棒研細，而后加入到壓片槽中做全波段（４０００－４００邋ｃｍ，，掃描。逡逑２．結(jié)果逡逑２．１ＧＢＥＰ的糖含量測定逡逑根據(jù)標準曲線Ｙ＝0．１１３Ｘ＋０．４２７７，邋Ｒ２＝０．９８，的糖含量為５１．９％。逡逑２．２ＧＢＥＰ的淀粉含量測定逡逑
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2574045