【摘要】：VEGF是一種促進血管生成的生長因子,在小鼠中已被證實可以促進毛發(fā)生長。而VEGFR-2作為VEGF最初的受體,對VEGF功能起到調(diào)節(jié)作用。VEGF在人類真皮毛乳頭細胞中被證實能夠通過VEGFR-2激活Erkl/2信號通路進而促進細胞的生長。在本研究中我們以通過轉(zhuǎn)基因手段獲得的產(chǎn)絨量明顯提高(10048)以及產(chǎn)絨量未發(fā)生明顯改善(10056)的內(nèi)蒙古阿爾巴斯轉(zhuǎn)VEGF基因白絨山羊做為研究對象,同時以同一細胞系體細胞克隆羊做為對照(NT),運用Real time-PCR以及Western Blot技術(shù)探究了VEGF以及VEGFR-2在皮膚組織中的表達情況,以及VEGF轉(zhuǎn)基因?qū)ζつw組織中細胞相關(guān)信號通路的影響。通過實時定量PCR檢測NT、10056和10048皮膚組織中VEGF及相關(guān)信號通路基因mRNA的表達情況。結(jié)果顯示,10056轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中VEGF表達量與NT沒有顯著差異,但其VEGFR-2的表達量較NT高,差異顯著(P0.05)；而10048轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中VEGF的表達量相較于NT高,差異顯著(P0.05),VEGFR-2的表達量相較于NT高,且差異極其顯著(P0.01)。檢測VEGF信號通路相關(guān)基因包括：PI3K,Akt,RelA, β-catenin, HIF1-α結(jié)果顯示,10048轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中β-catenin和PI3K基因的表達量與NT無顯著差異,HIF1-α的表達量較NT高,差異顯著(P0.05)。10056轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中β-catenin的表達量較NT高,差異顯著(P0.05), HIF1-α和PI3K的表達量較NT低,差異顯著(P0.05)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測三個絨山羊皮膚組織中VEGF、 VEGFR-2基因以及相關(guān)信號通路基因的蛋白表達結(jié)果顯示,10056轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中VEGF的表達量較NT絨山羊皮膚組組織高,為1.4倍；VEGFR2表達量較NT低,為0.9倍；Erk1/2、P-Erk、F-Akt、P38、P-P38的表達量較NT高,分別為1.54、1.14、1.92、1.3、3倍；Akt的表達量較NT低,為0.92倍。10048轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚組織中VEGF的表達量較NT高,為1.1倍；VEGFR-2表達量較NT高,為3.1倍；Erk1/2、 P-Erk、P-Akt、P38、P-P38的表達量較NT高,分別為1.74、1.1、1.24、1.19、2.26倍；Akt的表達量較NT低,為0.9倍。上述結(jié)果表明,產(chǎn)絨量明顯提高的轉(zhuǎn)基因絨山羊(10048)相較于同一細胞系體細胞克隆羊(NT),其皮膚組織中VEGF以及VEGFR-2基因的表達量升高,并且VEGF的高表達通過VEGFR-2引起Erk1/2表達上調(diào),P-Erk1/2表達上調(diào),因而激活了Erk1/2信號通路。且引起P38以及Akt基因的磷酸化情況上調(diào)。另外,本研究還利用內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊處于生長期的次級毛囊毛乳頭細胞(Secondary hair follice dermal papilla cells, SHF-DPCs)作為實驗材料,進行VEGF基因的過表達以及干擾實驗,探究VEGF,VEGFR-2基因以及相關(guān)信號通路基因表達情況的變化。通過實時定量PCR檢測VEGF過表達和敲減后VEGF和VEGFR-2在SHF-DPCs中mRNA的表達情況,結(jié)果表明電轉(zhuǎn)VEGF164干擾質(zhì)粒1(I-1)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表達量較電轉(zhuǎn)空質(zhì)粒(NC)后低,差異顯著。電轉(zhuǎn)VEGF 164干擾質(zhì)粒2(I-2)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表達量較NC低。電轉(zhuǎn)VEGF 164過表達載體(O-V)后SHF-DPCs中VEGF mRNA的表達量較NC高,且差異顯著；VEGFR-2 mRNA的表達量較NC高。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測VEGF過表達實驗和干擾實驗中VEGF和VEGFR-2蛋白的表達情況,結(jié)果顯示,I-1中VEGF、VEGFR-2的表達量相對NC中的表達量分別為0.6倍、0.69倍；I-2中VEGF、VEGFR-2的表達量相對于NC中的表達量分別為0.86倍、0.92倍；O-V中VEGFR、VEGFR-2的表達量相對于NC中的表達量分別為1.14倍、1.4倍。通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測VEGF過表達實驗和干擾實驗中VEGF、VEGFR-2相關(guān)信號通路基因蛋白的表達情況,包括Erk1/2、 P38和Akt基因。結(jié)果顯示I-1中Erk1/2、P38、Akt的表達量相對于NC中的表達量分別為0.82倍、1.01倍、0.59倍。I-2中Erk1/2、P38、 Akt的表達量相對于NC中的表達量分別為0.92倍、0.89倍、0.32倍。O-V中Erk1/2、P38、Akt的表達量相對于NC中的表達量分別為0.84倍、1.44倍、0.69倍。上述結(jié)果表明在SHF-DPCs的VEGF過表達實驗和干擾實驗中,VEGFR-2的表達量與VEGF表達量成正相關(guān)。這些結(jié)果為在內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊毛囊的發(fā)育及生長過程中VEGF相關(guān)信號通路的研究提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

ＶＥＧＦ１６４千擾載體１的基因干擾祀位點的位置及載體的詳細報告單見圖１，逡逑ＶＥＧＦ１６４干擾載體２的基因干擾祀位點的位置及載體的詳細報告單見圖２，逡逑ＶＥＧＦ１６４基因過表達質(zhì)粒的載體圖見圖３�？召|(zhì)粒為攜帶一個啟動子啟動綠色逡逑焚光蛋白的骨架質(zhì)粒。逡逑載體名稱．．邐ｐＧＰＵ６／ＧＦＰ／Ｎｅｏ－ＶＥＧＦ１６４－ｓｈＲＮＡ－３０９．＇邐產(chǎn)品包裝５００邋ｎｇ／ｕｌ，共邋５０邋ｕｇ－逡逑粑序列－邐ＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣ．逡逑５＊３邋ＣＡＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ＾逡逑ＳｈＤＮＡ－邐ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＷＣＡＡＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣ＾逡逑模板＊邐Ｔｈｅ邋ｍｏｓｔ邋Ｓｔａｂｌｅ邋３＊￣（ｆｃｎｅｒ５Ｂ邋ｂｐ，邋‘１１１．１邋ｋｃａｉｆａｗｌ逡逑席擁．邐ＣＡＣＣＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ邋５＇逡逑３．邋ｉ�。海牵裕椋裕粒粒裕欤簦椋椋。海ǎ。海椋兀椋裕裕裕椋椋剩辏蹋停裕蓿海裕茫裕茫悖欤剩剩耄蹋椋裕粒椋椋蓿椋裕祝椋欤牵粒ǎ。骸辏欤欤剩剩剩蓿蓿茫裕粒牵担义希蛇娺娺婂澹�，１逡逑轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－■邋ＧＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴＣＴＧＣＴＴ＾＾逡逑序列

通過實時定量ＰＣＲ檢測ＮＴ、１００５６和１００４８絨山羊皮膚組織中，ＶＥＧＦ相關(guān)信逡逑號通路基因的表達情況。檢測基因包括，ＶＥＧＦＲ－２、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ＲｅｌＡ、ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ、逡逑ＨＩＦｌ－ａ。如圖４，結(jié)果顯示，１００５６皮膚組織中ＶＥＧＦ表達量與ＮＴ皮膚組織中的逡逑表達量沒有顯著差異；ＶＥＧＦＲ－２的表達量較ＮＴ高，差異顯著（Ｐ＜０．０５）邋；邋Ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ逡逑的表達量與ＮＴ的表達量高，差異顯著（Ｐ＜０．０５）邋；邋ＨＩＦｌ－ａ和ＰＩ３Ｋ的表達量較逡逑ＮＴ的表達量低，差異顯著（Ｐ＜０．０５）。１００４８絨山羊皮膚組織中ＶＥＧＦ的表達量逡逑相較于ＮＴ高，差異顯著（Ｐ＜０．０５）邋；邋ＶＥＧＦＲ－２的表達量相較于ＮＴ高，，差異極其逡逑顯著（Ｐ＜０．０１）；邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ和ＰＩ３Ｋ基因的表達量與ＮＴ的表達量無顯著差異；ＨＩＦ１－逡逑ａ的表達量較ＮＴ的表達量高，差異顯著（Ｐ＜０．０５）。逡逑１８邋ｎ邐逡逑★邋－ｋ逡逑：：Ｉ逡逑ｊ邐１２邋Ｉ逡逑＾邐１０邐■邋邐邐—－邋邐邐＿邋ＮＴ逡逑？Ｉ＂邐８邐■邐邐■邋１００４８逡逑Ｉ邐６邐醒邋邐邐■邋１００５６逡逑Ｉ邋ｓ—ｍ—ｔ一：邐逡逑“０邋－邋Ｊｌｗ邋Ｉ邋Ｊｒｄｒ逡逑ＶＥＧＦ邋ＶＥＧＦＲ－２邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ邋ＨＩＦｌａ邋ＰＩ３Ｋ逡逑圖４：邋ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ－２及相關(guān)信號通路基因在ＮＴ、１００４８、１００５６絨山羊皮膚組織中的ｍＲＮＡ水平逡逑表達情況。ＮＴ：同一細胞系體細胞克隆羊；１００５６：產(chǎn)線量無顯著提高的ＶＥＧＦ１６４轉(zhuǎn)基因域山逡逑羊；１００４８：產(chǎn)域量顯著提高的ＶＥＧＦ１６４轉(zhuǎn)基因域山羊。＊差異顯著
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S827

【引證文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 梁紅宇;CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)絨山羊VEGF基因定點整合的研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

本文編號：2567957