【摘要】：藍(lán)舌病(Bluetongue disease,BT)是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的,由傳播媒介庫蠓在動(dòng)物間廣泛傳播的急性、烈性動(dòng)物傳染病。該病主要感染反芻動(dòng)物(山羊、綿羊、牛、鹿、駱駝等),其中以綿羊最易感,病畜被感染后主要表現(xiàn)出高熱、口腔黏膜發(fā)紺充血、面部水腫等癥狀,部分血清型可引起較高的死亡率。目前,BTV已多達(dá)27個(gè)血清型,各血清型之間無交叉保護(hù)作用,所以制備出針對某一特定血清型的BTV相關(guān)的診斷試劑是防治該病的最有效措施。BTV屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的成員,其基因組由10個(gè)分節(jié)段的雙股正鏈RNA組成,分別編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1~VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a及NS4)。其中,VP2能刺激產(chǎn)生型特異性中和抗體,NS3/NS3a參與病毒的釋放。根據(jù)Genbank中登陸的BTV15 L2基因序列(CAE51102.1)及S10基因序列(AGJ83560.1)分別設(shè)計(jì)一對特異性引物,以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的分別含有BTV15的VP2編碼序列以及NS3編碼序列的重組質(zhì)粒p ZERO-B15-VP2和PEASY-B15-NS3為模板擴(kuò)增VP2與NS3蛋白的編碼基因。并將兩者酶切處理后克隆于原核表達(dá)載體p MAL-C4X,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒p C4X-B15-VP2和p C4X-B15-NS3。另外,將L2基因克隆于真核表達(dá)載體p Fast BacTMHTA用于真核表達(dá)VP2蛋白;將S10基因克隆于原核表達(dá)載體PET-30a,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PET-B15-NS3。四種蛋白表達(dá)純化完成后,將原核重組VP2蛋白MBP-VP2和原核重組NS3蛋白HIS-NS3分別免疫4-6周齡的BALB/c小鼠以制備單克隆抗體(Monoclonal antibody,MAb)。取抗體滴度較高的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合,并分別以真核重組VP2蛋白BAC-B15-VP2和原核重組NS3蛋白M BP-NS3為包被抗原,以間接ELI SA方法對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選,最后獲得3株穩(wěn)定分泌抗BTV15VP2蛋白MAb的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為2C6、2D6、3B11;獲得4株穩(wěn)定分泌抗BTV15 NS3蛋白M Ab的雜交瘤細(xì)胞。分別命名為1B5、2B12、2G9、3D8。利用western-blot(WB)和IFA試驗(yàn)對上述MAbs進(jìn)行特異性鑒定,WB結(jié)果表明7株MAbs都能識別BTV15感染的BHK-21細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)蛋白;IFA結(jié)果表明2C6、2D6、3B11只與BTV15反應(yīng),而不與其他血清型BTV反應(yīng),而1B5、2B12、2G9、3D8與BTV1~24均發(fā)生反應(yīng)。利用肽掃描技術(shù)對該幾株MAbs識別的B細(xì)胞表位進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明2C6識別的抗原表位為62LKYRP66,2D6識別15IAPAIIKRYP24,3B11識別99DHDVDS104;1B5識別的抗原表位為205YNDAVRM SF213,2B12識別204SYNDAVRM SF213,2G9識別82AEAFRDDVRLRQIK95,3D8識別36PPRYA40。對不同血清型BTV的VP2序列及NS3序列進(jìn)行序列比對,結(jié)果表明BTV不同血清型間針對VP2的表位序列相似性較低,而針對NS3的表位序列相似性較高。本研究通過制備針對BTV15 VP2和NS3的MAbs及鑒定其抗原表位,以期為BTV15特異性抗原檢測診斷方法的建立以及BTV群特異性鑒定奠定一定的基礎(chǔ),并在對BTV的基礎(chǔ)研究方面也有重要的意義。
【圖文】：

圖 2-4 BTV15 VP2 蛋白 3 株 Mabs 與天然 BTV15 VP2 蛋白 WB 鑒定Fig.2-4 The reactivity of anti-BTV15 VP2 M abs with native BTV15 VP2 protein by Wained protein marker; lane 1: lysate of uninfected BHK-21 cells; lane 2:BHK21 cell infected驗(yàn)中，在未感染病毒細(xì)胞對照及陰陽性對照作用下，3株MAbs 均只與B胞發(fā)生反應(yīng)(圖2-5)，而不與BTV1~14、BTV16~24、IBAV以及CV感染的B圖未列出)，結(jié)果表明3株MAbs均具有良好的型特異性。 2 3

BTV15VP2MAbs的IFA試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

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相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

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本文編號：2556987