【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜(Postweaning mμLtisystemic wasting syndrome,PMWS)的發(fā)生密切相關(guān),是其主要原發(fā)病原。PCV2還與豬皮炎腎病綜合征、豬A2型先天性震顫、豬呼吸道病綜合征等傳染性疾病的發(fā)生相關(guān)。PMWS主要流行于5~18周齡的斷奶仔豬,致死率較高,其臨床癥狀主要呈現(xiàn)為:仔豬生長(zhǎng)速率降低、體重減輕、呼吸急迫、皮炎、黃疸、淋巴結(jié)病變腫大等。PCV2在世界范圍內(nèi)的感染與流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害與經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)PCV2的防控主要依靠疫苗,國(guó)內(nèi)外也先后注冊(cè)了全病毒滅活苗、重組嵌合苗和亞單位疫苗,在預(yù)防PCV2感染中發(fā)揮了重要作用。由于進(jìn)口疫苗價(jià)格昂貴,而國(guó)產(chǎn)滅活疫苗效果仍不夠理想,因而研制高效、廉價(jià)、安全的新型PCV2亞單位疫苗的需要已日益迫切�；赑CV2結(jié)構(gòu)蛋白(Capsid)能在體外自組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的特性,我們采用大腸桿菌高密度發(fā)酵的方法對(duì)重組的Cap蛋白進(jìn)行了可溶性表達(dá),并純化制備成病毒樣顆粒,為新型PCV2 VLPs亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ),本研究主要分為以下幾個(gè)部分:(1)將含有pET28a-ORF2質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21DE3,進(jìn)行了高密度發(fā)酵試驗(yàn),并對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了摸索,建立了比較穩(wěn)定的10 L發(fā)酵罐體系,收獲濕菌體量達(dá)93.9±1.9g/L;且得到的重組Cap蛋白以可溶形式存在,為重組Cap蛋白的純化及PCV2疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。(2)將高密度發(fā)酵所得菌體進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎。所得上清用硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步除雜,然后采用IEC SP FF陽離子交換層析柱進(jìn)行純化,并對(duì)相應(yīng)條件進(jìn)行了摸索,得到相對(duì)純度達(dá)85%以上的Cap蛋白,并對(duì)Cap蛋白體外組裝病毒樣顆粒(VLPs)條件進(jìn)行了摸索,成功制備了與PCV2天然病毒結(jié)構(gòu)相似的VLPs。(3)建立評(píng)價(jià)PCV2 Cap蛋白體外穩(wěn)定性的雙抗夾心ELISA檢測(cè),使用該方法檢測(cè)了不同貯存溫度、不同反復(fù)凍融次數(shù)、不同保護(hù)劑等條件下Cap蛋白的活性變化。結(jié)果顯示,Cap蛋白在25°C以下貯存時(shí),其活性保持穩(wěn)定;貯存時(shí)不同溫度間變換對(duì)蛋白穩(wěn)定性影響較大;在甘氨酸和甘油2種蛋白保護(hù)劑存在條件下蛋白活性的穩(wěn)定性增強(qiáng)。(4)利用高純度Cap蛋白組裝的VLPs作為抗原,分別免疫Balb/c小鼠和仔豬;通過檢測(cè)抗體效價(jià)及動(dòng)物的生產(chǎn)性能對(duì)疫苗免疫進(jìn)行評(píng)價(jià)。小鼠免疫評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中,VLPs抗原分別與50V礦物油、IMS1313及卡波姆等佐劑按一定比例混合,制備PCV2重組VLPs疫苗;分別將生理鹽水、勃林格豬圓環(huán)病毒2型疫苗分別設(shè)為陰性和陽性對(duì)照,對(duì)接種后12周內(nèi)抗體效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)與分析。結(jié)果顯示,同種劑量情況下,油佐劑免疫效果與陽性對(duì)照組相當(dāng),抗體效價(jià)于第2周開始持續(xù)上升,并長(zhǎng)期維持在較高水平,而水性佐劑表現(xiàn)較差。進(jìn)行兩次仔豬臨床生產(chǎn)性能評(píng)價(jià),每次選取150頭仔豬,分為50V油佐劑疫苗注射組、生理鹽水組、勃林格疫苗組,分別在15日齡注射1mL,記錄生產(chǎn)性能。其中第一批免疫生理鹽水組增重率高于勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組,分別為200%、189%、180%,疫苗免疫效果不理想;而在第二批免疫中勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組增重率高于生理鹽水組,分別為296%、304%、252%;表明配制的重組VLPs油佐劑亞單位疫苗有相對(duì)較好的免疫效果。本研究的意義在于成功建立了能夠可溶表達(dá)PCV2重組Cap蛋白的大腸桿菌高密度發(fā)酵體系;純化制備純度較高的Cap蛋白,并對(duì)其進(jìn)行了外穩(wěn)定性進(jìn)行了探索,且成功制備出了PCV2的VLPs;將所得VLPs與各類佐劑配合制成了不同的亞單位疫苗,并對(duì)其免疫效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)分析,最終確定50V油佐劑疫苗具有良好的免疫效果,為PCV2亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28

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