【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus 2,PCV2)與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜(Postweaning mμLtisystemic wasting syndrome,PMWS)的發(fā)生密切相關(guān),是其主要原發(fā)病原。PCV2還與豬皮炎腎病綜合征、豬A2型先天性震顫、豬呼吸道病綜合征等傳染性疾病的發(fā)生相關(guān)。PMWS主要流行于5~18周齡的斷奶仔豬,致死率較高,其臨床癥狀主要呈現(xiàn)為:仔豬生長速率降低、體重減輕、呼吸急迫、皮炎、黃疸、淋巴結(jié)病變腫大等。PCV2在世界范圍內(nèi)的感染與流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害與經(jīng)濟(jì)損失。目前對PCV2的防控主要依靠疫苗,國內(nèi)外也先后注冊了全病毒滅活苗、重組嵌合苗和亞單位疫苗,在預(yù)防PCV2感染中發(fā)揮了重要作用。由于進(jìn)口疫苗價格昂貴,而國產(chǎn)滅活疫苗效果仍不夠理想,因而研制高效、廉價、安全的新型PCV2亞單位疫苗的需要已日益迫切�；赑CV2結(jié)構(gòu)蛋白(Capsid)能在體外自組裝成病毒樣顆粒(Virus-like particles,VLPs)的特性,我們采用大腸桿菌高密度發(fā)酵的方法對重組的Cap蛋白進(jìn)行了可溶性表達(dá),并純化制備成病毒樣顆粒,為新型PCV2 VLPs亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ),本研究主要分為以下幾個部分:(1)將含有pET28a-ORF2質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21DE3,進(jìn)行了高密度發(fā)酵試驗,并對發(fā)酵條件進(jìn)行了摸索,建立了比較穩(wěn)定的10 L發(fā)酵罐體系,收獲濕菌體量達(dá)93.9±1.9g/L;且得到的重組Cap蛋白以可溶形式存在,為重組Cap蛋白的純化及PCV2疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。(2)將高密度發(fā)酵所得菌體進(jìn)行高壓均質(zhì)破碎。所得上清用硫酸銨沉淀法進(jìn)行初步除雜,然后采用IEC SP FF陽離子交換層析柱進(jìn)行純化,并對相應(yīng)條件進(jìn)行了摸索,得到相對純度達(dá)85%以上的Cap蛋白,并對Cap蛋白體外組裝病毒樣顆粒(VLPs)條件進(jìn)行了摸索,成功制備了與PCV2天然病毒結(jié)構(gòu)相似的VLPs。(3)建立評價PCV2 Cap蛋白體外穩(wěn)定性的雙抗夾心ELISA檢測,使用該方法檢測了不同貯存溫度、不同反復(fù)凍融次數(shù)、不同保護(hù)劑等條件下Cap蛋白的活性變化。結(jié)果顯示,Cap蛋白在25°C以下貯存時,其活性保持穩(wěn)定;貯存時不同溫度間變換對蛋白穩(wěn)定性影響較大;在甘氨酸和甘油2種蛋白保護(hù)劑存在條件下蛋白活性的穩(wěn)定性增強(qiáng)。(4)利用高純度Cap蛋白組裝的VLPs作為抗原,分別免疫Balb/c小鼠和仔豬;通過檢測抗體效價及動物的生產(chǎn)性能對疫苗免疫進(jìn)行評價。小鼠免疫評價實驗中,VLPs抗原分別與50V礦物油、IMS1313及卡波姆等佐劑按一定比例混合,制備PCV2重組VLPs疫苗;分別將生理鹽水、勃林格豬圓環(huán)病毒2型疫苗分別設(shè)為陰性和陽性對照,對接種后12周內(nèi)抗體效價進(jìn)行檢測與分析。結(jié)果顯示,同種劑量情況下,油佐劑免疫效果與陽性對照組相當(dāng),抗體效價于第2周開始持續(xù)上升,并長期維持在較高水平,而水性佐劑表現(xiàn)較差。進(jìn)行兩次仔豬臨床生產(chǎn)性能評價,每次選取150頭仔豬,分為50V油佐劑疫苗注射組、生理鹽水組、勃林格疫苗組,分別在15日齡注射1mL,記錄生產(chǎn)性能。其中第一批免疫生理鹽水組增重率高于勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組,分別為200%、189%、180%,疫苗免疫效果不理想;而在第二批免疫中勃林格疫苗組和50V油佐劑疫苗組增重率高于生理鹽水組,分別為296%、304%、252%;表明配制的重組VLPs油佐劑亞單位疫苗有相對較好的免疫效果。本研究的意義在于成功建立了能夠可溶表達(dá)PCV2重組Cap蛋白的大腸桿菌高密度發(fā)酵體系;純化制備純度較高的Cap蛋白,并對其進(jìn)行了外穩(wěn)定性進(jìn)行了探索,且成功制備出了PCV2的VLPs;將所得VLPs與各類佐劑配合制成了不同的亞單位疫苗,并對其免疫效果進(jìn)行了評價分析,最終確定50V油佐劑疫苗具有良好的免疫效果,為PCV2亞單位疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁士哲;魏喜仁;范文光;王振山;李遠(yuǎn)志;吳士芳;徐慶;渠川玫;彭傳貴;;狗傳染性腸炎的研究 1、腹瀉狗糞便中檢出的細(xì)小病毒樣顆粒[J];上海畜牧獸醫(yī)通訊;1982年04期

2 王亞君;華育平;;病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2008年05期

3 程幫照;劉華;;病毒樣顆粒內(nèi)標(biāo)在熒光定量RT-PCR檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒方法中的應(yīng)用[J];中國畜牧獸醫(yī);2014年07期

4 宋振輝;卿家超;買買提·艾孜子;齊曉娟;葉翠芳;;豬傳染性胃腸炎病毒樣顆粒在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的體外組裝[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2014年06期

5 王亞君;華育平;;病毒樣顆粒疫苗的研究進(jìn)展[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年08期

6 張國廣;郭遲鳴;歐陽瑩;黃小君;陳亮;;病毒樣顆粒為陽性對照的H5N1實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J];廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2014年03期

7 毛凝;;病毒樣顆粒疫苗的研究及其在動物疫病防控中的應(yīng)用前景[J];農(nóng)業(yè)開發(fā)與裝備;2013年01期

8 張樹梅;黃海碧;顏丕熙;滕巧泱;閆麗萍;徐大偉;呼和巴特爾;李澤君;;影響A型流感病毒樣顆粒包裝及釋放的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白研究[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年13期

9 王宇;張曉文;王群;梁成珠;汪東風(fēng);;含馬動脈炎病毒N基因的病毒樣顆粒的制備[J];畜牧與獸醫(yī);2014年06期

10 徐志文;郭萬柱;陳楊;朱玲;陳燕凌;王印;;聯(lián)合表達(dá)PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒樣顆粒獲得及免疫原性[J];中國獸醫(yī)學(xué)報;2009年07期

相關(guān)會議論文 前7條

1 陳霄;周子華;廖玉華;王敏;;乙肝核心病毒樣顆粒的克隆、改建、表達(dá)和純化[A];中華醫(yī)學(xué)會第11次心血管病學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

2 戚宇華;崔侖標(biāo);史智揚(yáng);葛以躍;李顯;單軍;陸祖宏;;H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備與應(yīng)用[A];第十一次中國生物物理學(xué)術(shù)大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

3 柯昌文;李天成;武田直和;;BK病毒VP1的C端陽電荷殘基對病毒樣顆粒形成的影響[A];2004年中國科學(xué)院新生病毒性疾病控制學(xué)術(shù)討論會摘要集[C];2004年

4 魏蘭蘭;;16型人乳頭瘤病毒疫苗的研究進(jìn)展[A];慶祝黑龍江省免疫學(xué)會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

5 仝光杰;樓覺人;;HPV52 L1蛋白在畢赤酵母中的優(yōu)化表達(dá)[A];第五次全國免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2011年

6 張艷;鄭龍;宋淑霞;魏林;;對攜帶HCC表位的HBc病毒樣顆粒負(fù)載的DC疫苗的免疫評價[A];河北省免疫學(xué)會第六次免疫學(xué)大會資料匯編[C];2010年

7 胡仲廉;焉晉絢;查世欽;劉克相;方華;劉靜敏;戈士文;;病毒樣顆�！环N與食管癌密切相關(guān)的實體結(jié)構(gòu)及其立體構(gòu)型[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 通訊員 于洋　記者 張兆軍;病毒樣顆粒熒光示蹤研究獲重要進(jìn)展[N];科技日報;2011年

2 孫國根;新型HIV—1病毒樣顆粒表達(dá)系統(tǒng)制備成功[N];中國醫(yī)藥報;2012年

3 俞忠良;我國克隆出SARS病毒樣顆粒[N];健康報;2003年

，

本文編號：2556862