獺兔腸黏膜乳桿菌的分離鑒定及其體外益生特性研究
發(fā)布時間：2019-11-05 12:47
【摘要】：【目的】分離篩選適于在獺兔腸道中存活并定殖的高黏附性乳酸菌株�！痉椒ā客ㄟ^乳酸菌選擇性培養(yǎng)基從5和10日齡哺乳獺兔腸黏膜中分離具有抑制大腸桿菌活性的菌株,經(jīng)16SrRNA基因序列分析進行鑒定,并檢測其耐人工胃液、耐膽鹽及黏附特性、表面疏水性等益生特性�！窘Y(jié)果】分離篩選出3株具有較強抑制大腸桿菌活性的菌株,分別鑒定為短乳桿菌(L1)、植物乳桿菌(L2)、干酪乳桿菌(L3),其抑菌活性大小為L3L2L1。3株菌株均能耐受pH=4.0的人工胃液;在pH=3.0人工胃液中,L2和L3的活菌含量未出現(xiàn)明顯變化(P0.05),而L1的活菌含量顯著下降(P0.05);3株菌株在pH=2.0和pH=1.8人工胃液中的活菌含量均顯著降低(P0.01)。L1和L2均能耐受2.0g/L膽鹽;雖然L1和L2在3.0g/L膽鹽中的活菌量出現(xiàn)極顯著(P0.01)和顯著(P0.05)下降,但二者仍保留較高活菌含量;膽鹽對L3的存活有明顯抑制作用,隨著膽鹽含量的升高,L3的活菌含量極顯著降低(P0.01)。L2和L3對黏蛋白的黏附率無顯著差異(P0.05),均顯著高于L1(P0.05)。L3的表面疏水性最高,L2次之,二者之間無顯著差異(P0.05);L1的表面疏水性低于L2(P=0.092),顯著低于L3(P0.05)。【結(jié)論】分離所獲得的3株乳桿菌均具備益生菌特性,其中以植物乳桿菌L2最佳。
【圖文】：
℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。試驗設(shè)空白對照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板進行擴增。ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將１６ＳｒＲＮＡ基因測序結(jié)果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列進行同源性比較和菌種鑒定。用ＭＥＧＡ５．１０軟件分析所測菌株序列和其他與乳酸菌屬（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性較高菌種的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。１．５分離菌株對人工胃液和膽鹽的耐受性檢測分離菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性檢測參考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法進行。取細菌含量為１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鮮懸浮液與含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的無菌電解質(zhì)溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等體積混合。為模擬菌株從食管入胃的環(huán)境特點，各菌株每培養(yǎng)２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ調(diào)整混合培養(yǎng)液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低為５．０，４．０，３．０，２．０；最后調(diào)整混合培養(yǎng)液ｐＨ值為１．８，培養(yǎng)３０ｍｉｎ。分別在培養(yǎng)２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培養(yǎng)液，用平板計數(shù)法測定各菌株在連續(xù)不同ｐＨ值培養(yǎng)條件下的活菌含量。將各分離菌株的新鮮懸浮液（菌含量為１０
℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。試驗設(shè)空白對照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板進行擴增。ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將１６ＳｒＲＮＡ基因測序結(jié)果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列進行同源性比較和菌種鑒定。用ＭＥＧＡ５．１０軟件分析所測菌株序列和其他與乳酸菌屬（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性較高菌種的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。１．５分離菌株對人工胃液和膽鹽的耐受性檢測分離菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性檢測參考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法進行。取細菌含量為１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鮮懸浮液與含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的無菌電解質(zhì)溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等體積混合。為模擬菌株從食管入胃的環(huán)境特點，各菌株每培養(yǎng)２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ調(diào)整混合培養(yǎng)液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低為５．０，４．０，３．０，２．０；最后調(diào)整混合培養(yǎng)液ｐＨ值為１．８，培養(yǎng)３０ｍｉｎ。分別在培養(yǎng)２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培養(yǎng)液，用平板計數(shù)法測定各菌株在連續(xù)不同ｐＨ值培養(yǎng)條件下的活菌含量。將各分離菌株的新鮮懸浮液（菌含量為１０
本文編號：2556186
【圖文】：
℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。試驗設(shè)空白對照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板進行擴增。ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將１６ＳｒＲＮＡ基因測序結(jié)果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列進行同源性比較和菌種鑒定。用ＭＥＧＡ５．１０軟件分析所測菌株序列和其他與乳酸菌屬（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性較高菌種的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。１．５分離菌株對人工胃液和膽鹽的耐受性檢測分離菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性檢測參考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法進行。取細菌含量為１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鮮懸浮液與含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的無菌電解質(zhì)溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等體積混合。為模擬菌株從食管入胃的環(huán)境特點，各菌株每培養(yǎng)２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ調(diào)整混合培養(yǎng)液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低為５．０，４．０，３．０，２．０；最后調(diào)整混合培養(yǎng)液ｐＨ值為１．８，培養(yǎng)３０ｍｉｎ。分別在培養(yǎng)２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培養(yǎng)液，用平板計數(shù)法測定各菌株在連續(xù)不同ｐＨ值培養(yǎng)條件下的活菌含量。將各分離菌株的新鮮懸浮液（菌含量為１０
℃３０ｓ，５５℃９０ｓ，７２℃３０ｓ，３５個循環(huán)；７２℃２ｍｉｎ；４℃保存。試驗設(shè)空白對照，以ｄｄＨ２Ｏ代替模板進行擴增。ＰＣＲ擴增產(chǎn)物經(jīng)１０ｇ／Ｌ瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Ａｘｙｇｅｎ核酸純化試劑盒純化回收，送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將１６ＳｒＲＮＡ基因測序結(jié)果提交到ＧｅｎＢａｎｋ，使用Ｂｌａｓｔ程序與ＧｅｎＢａｎｋ數(shù)據(jù)庫中的乳酸菌１６ＳｒＲＮＡ序列進行同源性比較和菌種鑒定。用ＭＥＧＡ５．１０軟件分析所測菌株序列和其他與乳酸菌屬（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）同源性較高菌種的１６ＳｒＲＮＡ基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。１．５分離菌株對人工胃液和膽鹽的耐受性檢測分離菌株的人工胃液（ＳＥＳ）耐受性檢測參考Ｇａｒｃíａ－Ｒｕｉｚ等［１０］的方法進行。取細菌含量為１０８～１０９ＣＦＵ／ｍＬ的各菌株新鮮懸浮液與含６ｇ／Ｌ胃蛋白酶的無菌電解質(zhì)溶液（０．４４ｇ／ＬＣａＣｌ２，１２．４ｇ／ＬＮａＣｌ，４．４ｇ／ＬＫＣｌ，２．４ｇ／ＬＮａＨＣＯ３）等體積混合。為模擬菌株從食管入胃的環(huán)境特點，各菌株每培養(yǎng)２０ｍｉｎ后立即用１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ調(diào)整混合培養(yǎng)液的ｐＨ值，由起始ｐＨ＝６．２逐步降低為５．０，４．０，３．０，２．０；最后調(diào)整混合培養(yǎng)液ｐＨ值為１．８，培養(yǎng)３０ｍｉｎ。分別在培養(yǎng)２０，４０，６０，８０，１００和１３０ｍｉｎ采集各菌株培養(yǎng)液，用平板計數(shù)法測定各菌株在連續(xù)不同ｐＨ值培養(yǎng)條件下的活菌含量。將各分離菌株的新鮮懸浮液（菌含量為１０
本文編號：2556186
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