【摘要】：遺傳學(xué)的研究表明,KISS-1和Gn RH是控制包括綿羊在內(nèi)的動物發(fā)情的關(guān)鍵基因。雖然已知綿羊Gn RH的表達(dá)受kisspeptin的調(diào)控,但具體的分子機(jī)理尚不清楚。本研究以季節(jié)性繁殖的阿勒泰綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動物,利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),并結(jié)合生物信息學(xué)分析手段,對綿羊kisspeptin介導(dǎo)的Gn RH基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制進(jìn)行了研究。首先,利用胚胎日齡為55~90天的綿羊胚胎下丘腦組織,成功建立了原代綿羊下丘腦神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系,體外培養(yǎng)的胎羊下丘腦細(xì)胞保留了在體內(nèi)下丘腦神經(jīng)元的形態(tài)和功能特征;然后,成功克隆了綿羊Gn RH基因啟動子區(qū)-2313bp~+173bp不同長度的片段,并構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告基因重組載體p GL3-1、p GL3-2、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8;第三,通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),p GL3-1、p GL3-2、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8與空載體p GL3-Basic相比有明顯的活性(P0.05),其中p GL3-1、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8載體的表達(dá)活性較為相似(P0.05),而p GL3-2載體的表達(dá)活性極顯著高于空載體及其他載體(P0.05),進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析表明,綿羊Gn RH啟動子區(qū)存在有轉(zhuǎn)錄因子Otx-2的結(jié)合位點(diǎn);最后,運(yùn)用RT-PCR和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),對KISS-1及Otx-2、Gn RH、MT1基因的組織表達(dá)譜進(jìn)行了研究,并從細(xì)胞和個(gè)體水平證明kisspeptin通過Otx-2對Gn RH基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果,得出如下結(jié)論:綿羊Gn RH基因核心啟動子位于-1843bp~-1503bp大約300bp的區(qū)域內(nèi),而在-2313bp~-1843bp的區(qū)域內(nèi)可能有負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件存在;轉(zhuǎn)錄因子Otx-2可結(jié)合于Gn RH啟動子-1508bp~-1503bp位點(diǎn),kisspeptin可能通過Otx-2調(diào)控Gn RH基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2556432