【摘要】：遺傳學的研究表明,KISS-1和Gn RH是控制包括綿羊在內(nèi)的動物發(fā)情的關鍵基因。雖然已知綿羊Gn RH的表達受kisspeptin的調控,但具體的分子機理尚不清楚。本研究以季節(jié)性繁殖的阿勒泰綿羊為實驗動物,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)、RT-PCR和實時熒光定量PCR技術,并結合生物信息學分析手段,對綿羊kisspeptin介導的Gn RH基因表達調控的機制進行了研究。首先,利用胚胎日齡為55~90天的綿羊胚胎下丘腦組織,成功建立了原代綿羊下丘腦神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系,體外培養(yǎng)的胎羊下丘腦細胞保留了在體內(nèi)下丘腦神經(jīng)元的形態(tài)和功能特征;然后,成功克隆了綿羊Gn RH基因啟動子區(qū)-2313bp~+173bp不同長度的片段,并構建了熒光素酶報告基因重組載體p GL3-1、p GL3-2、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8;第三,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn),p GL3-1、p GL3-2、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8與空載體p GL3-Basic相比有明顯的活性(P0.05),其中p GL3-1、p GL3-3、p GL3-4、p GL3-5、p GL3-6、p GL3-7、p GL3-8載體的表達活性較為相似(P0.05),而p GL3-2載體的表達活性極顯著高于空載體及其他載體(P0.05),進一步的生物信息學分析表明,綿羊Gn RH啟動子區(qū)存在有轉錄因子Otx-2的結合位點;最后,運用RT-PCR和熒光實時定量PCR技術,對KISS-1及Otx-2、Gn RH、MT1基因的組織表達譜進行了研究,并從細胞和個體水平證明kisspeptin通過Otx-2對Gn RH基因的表達進行調控。綜合以上試驗結果,得出如下結論:綿羊Gn RH基因核心啟動子位于-1843bp~-1503bp大約300bp的區(qū)域內(nèi),而在-2313bp~-1843bp的區(qū)域內(nèi)可能有負轉錄調控元件存在;轉錄因子Otx-2可結合于Gn RH啟動子-1508bp~-1503bp位點,kisspeptin可能通過Otx-2調控Gn RH基因的表達。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S826

【參考文獻】

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本文編號：2556432