發(fā)布時(shí)間：2019-11-03 07:04

【摘要】：近年來(lái),江蘇地區(qū)許多鵝養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一種感染雛鵝為主的以出血性壞死性肝炎為特征的病毒性傳染病。我們以發(fā)病鵝場(chǎng)采集患病鵝的實(shí)質(zhì)性器官為病料,通過(guò)接種SPF雞胚進(jìn)行病毒的分離,并結(jié)合臨床癥狀和病理變化,通過(guò)PCR、RT-PCR等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒進(jìn)行鑒定,確定為鵝呼腸孤病毒。暫時(shí)將本分離株命名為GRV JS2012。為了確定該病毒的分類學(xué)地位,我們通過(guò)有機(jī)溶劑敏感試驗(yàn),溫度敏感試驗(yàn),血凝試驗(yàn)等證明該病毒為RNA病毒、不具有雞血紅細(xì)胞凝集特性,病毒對(duì)酸及氯仿不敏感,對(duì)胰蛋白酶敏感,對(duì)熱有一定的抵抗力。然后將病毒液進(jìn)行氯仿抽提、超高速差速離心及蔗糖密度梯度處理來(lái)純化病毒,經(jīng)磷酸鎢負(fù)染色進(jìn)行電鏡觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該病毒顆粒無(wú)囊膜、近似球形、直徑約為80nm,具有雙層衣殼結(jié)構(gòu),每層均為20面體對(duì)稱,具有典型的呼腸孤病毒屬特性。我們將病毒液通過(guò)絨毛尿囊膜接種9-11日齡的SPF雞胚,連續(xù)觀察2-6天,收集死亡雞胚尿囊液及尿囊膜,依次接種至第3代。用第3代的尿囊液、胚體及絨毛尿囊膜測(cè)定ELD50。結(jié)果測(cè)得尿囊液的ELD50為10-5.633/0.2mL,胚體及絨毛尿囊膜對(duì)雞胚的ELD50為10-583/0.2mL,表明胚體與絨毛尿囊膜的含毒量高于尿囊液。并將傳代后的病毒尿囊液用于雞胚成纖維細(xì)胞適應(yīng)性試驗(yàn),在原代雞胚成纖維細(xì)胞上盲傳5代,測(cè)定其TCID50,結(jié)果表明該毒株病毒對(duì)CEF的TCID50為10-5·75/0.1mL。此外,動(dòng)物致病性試驗(yàn)表明,本分離株可以致死1日齡雛鵝,死亡率為100%,而對(duì)于青年鵝及中年鵝不致病。然后,我們依據(jù)NCBI已經(jīng)發(fā)表的鵝呼腸孤病毒的基因序列,設(shè)計(jì)了3段引物。采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到3段目的片段,并對(duì)其序列進(jìn)行測(cè)定分析,結(jié)果表明與已經(jīng)發(fā)表的鴨呼腸孤病毒和鵝呼腸孤病毒親緣性較近,通過(guò)單個(gè)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示,本分離株與參考株03G株、J18株同源性高達(dá)80%-90%,與標(biāo)準(zhǔn)株S1133同源性較低。由此可知,本分離株應(yīng)該歸屬于禽正呼腸孤病毒屬不同于雞呼腸孤病毒分支的水禽呼腸孤病毒分支。最后,為了進(jìn)一步了解本分離株與ARV、DRV及GRV之間的進(jìn)化關(guān)系,我們對(duì)其進(jìn)行全基因組序列分析。根據(jù)已發(fā)表的基因序列設(shè)計(jì)了13對(duì)引物,采用RT-PCR方法擴(kuò)增得到目的片段,送至測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理,分析其開(kāi)放閱讀框的大小及數(shù)目,并與呼腸孤病毒屬的其他成員對(duì)比,繪制成基因進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明GRV JS2012株病毒全長(zhǎng)23,418bp,可分為大小不同的10個(gè)片段,組成病毒的10個(gè)片段大小如下：S1,1568bp； S2,1326bp；S3,1202bp；S4,1191bp；M1,2283bp；M2,2158bp；M3,1996bp；L1, 3958bp；L2,3829bp；L3,3907bp.與ARV其他毒株不同的是,GRV JS2012的σC蛋白由S1基因編碼,而ARV的6C由S4編碼。本分離株與ARV其他毒株一樣其5’端和3’端都存在保守序列,分別是5’一GCUUUU,3'-UCAUC。同源性分析表明GRV JS2012毒株與GRV 03G株相比,其核苷酸同源性高達(dá)89.7%-99.1%。與鴨源呼腸孤病毒DRV J18基因序列的同源性達(dá)20.4%-96.9%,其中以L1、L2、M1及S2的基因變異性較大；與雞源呼腸孤病毒ARV S1133株基因序列同源性達(dá)20.8%-77.0%。由此,我們認(rèn)為應(yīng)該將GRVJS2012歸屬于水禽呼腸孤病毒屬,而與雞呼腸孤病毒不同屬。基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,本分離株與鵝源呼腸孤病毒同屬一支,而與鴨呼腸孤病毒存在一定的差異,與雞呼腸孤病毒處在不同分支。由此可知,不同的呼腸孤病毒毒株之間存在著遺傳多樣性。而不同毒株之間是否存在基因重組的現(xiàn)象仍需進(jìn)一步的探討。本實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展為本病毒的進(jìn)一步研究提供了可靠的依據(jù)。
【圖文】：

Ａ邐Ｂ逡逑圖２－２；邋ＣＥＦ感染結(jié)果。Ａ：病變沮，Ｂ：正常組逡逑Ｆｉｇ邋２－２；邋Ｔｈｅ邋Ｋｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｖｉｒｕｓ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ邋ＣＥＦ．邋Ａ：邋ｖｉｍｓ－ｉｎｆｅｃ邋化邋ｄ邋ＣＥＦ．Ｂ：ｎｏｒｍａｌ邋ＣＥＦ逡逑３N４電鏡觀祭結(jié)果逡逑負(fù)染電鏡觀察。結(jié)果可知本病毒粒子無(wú)囊膜，呈球形，可見(jiàn)有雙層衣殼結(jié)構(gòu)，，直徑在逡逑６０－８０ｎｍ邋么間（圖邋２－３）。逡逑

圖２－２；邋ＣＥＦ感染結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65

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本文編號(hào)：2554966