【摘要】：奶牛乳腺炎是產(chǎn)后重要的常見(jiàn)疾病之一,其主要以病原菌入侵乳腺組織,并通過(guò)宿主逃逸機(jī)制在乳腺組織生存下來(lái),從而進(jìn)一步出現(xiàn)免疫細(xì)胞在乳腺內(nèi)聚積、活性氧自由基(ROS)蓄積和炎性因子釋放等病理學(xué)特征。該疾病每年對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。硒(Se)是動(dòng)物機(jī)體所必須的微量元素,其主要以硒蛋白的形式存在于機(jī)體內(nèi),發(fā)揮著抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和參與新陳代謝的生理功能。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)硒可以提高哺乳期大鼠的免疫能力,提高抗氧化酶活性,抑制炎癥反應(yīng),減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成的損傷。因此,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究硒的抗氧化作用以及硒對(duì)凋亡相關(guān)通路蛋白的影響,為防治乳腺炎提供理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)用金黃色葡萄球菌按照MOI=1:1的比例接種奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs),作用0、1、2、4、6、8、10、12和24h,用CCK8法檢測(cè)金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響,用LDH檢測(cè)試劑盒觀察金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞造成的損傷作用,用流式細(xì)胞術(shù)觀察金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞ROS水平的影響。結(jié)果顯示:接種金黃色葡萄球菌后,隨著時(shí)間的推移,奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力顯著下降,感染6、8和1 0h后,活力僅為80%、78.3%和77.3%;但LDH的活性逐漸提高,并在6h后極顯著增加(p0.01或p0.001);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,從4h開(kāi)始,奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著提高(p0.05),當(dāng)侵襲8h時(shí),ROS水平達(dá)到峰值,8h以后ROS水平顯著下降(p0.05)。所以,采用MOI=1:1的比例接種金黃色葡萄球菌侵襲奶牛乳腺上皮細(xì)胞6、8、10h造成了細(xì)胞的氧化損傷,確定了氧化損傷模型的處理時(shí)間。為研究硒在細(xì)胞抗氧化反應(yīng)過(guò)程中對(duì)相關(guān)氧化因子的影響,在培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒(2、4和8μM),檢測(cè)硒對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px、COX-2和iNOS mRNA的表達(dá)影響,T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響和MDA含量影響。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,金黃色葡萄球菌感染乳腺上皮細(xì)胞后,SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表達(dá)均無(wú)顯著變化。與金黃色葡萄球菌感染組,感染6h后,4、8μM的硒能顯著或極顯著的上調(diào)SOD的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.001),2、4μM的硒能顯著或極顯著的上調(diào)CAT和GSH-Px的mRNA表達(dá)(p0.05或p0.001);感染8h后,8μM的硒能極顯著的上調(diào)SOD和CAT的mRNA表達(dá),2、8μM的硒能極顯著的上調(diào)GSH-Px的mRNA表達(dá)(p0.01或p0.001)。在感染后6、8和10h,與對(duì)照組相比,金黃色葡萄球菌極顯著提高COX-2和iNOS的mRNA表達(dá)(p0.001)。金黃色葡萄球菌感染感染6h后,硒能極顯著抑制這一反應(yīng)(p0.001);感染8h后,4μM的硒能極顯著抑制COX-2的mRNA表達(dá)(p0.001),硒能極顯著抑制iNOS的mRNA表達(dá)(p0.001);感染10h后,2、8μM的硒能極顯著下調(diào)COX-2的mRNA表達(dá)(p0.001),4、8μM的硒能極顯著抑制iNOS mRNA表達(dá)(p0.001)。在感染后6、8和10h,與對(duì)照組相比,金黃色葡萄球菌顯著或極顯著抑制了 T-AOC、T-SOD、CAT 的活性(p0.05 或p0.01),極顯著增加 MDA 的含量(p0.001)。而與金黃色葡萄球菌感染組,硒能極顯著提高T-AOC、T-SOD、CAT和GSH-Px的活性(p0.01 或p0.001),極顯著減少 MDA 的含量(p0.001)。金黃色葡萄球菌除了能造成氧化損傷,產(chǎn)生炎癥反應(yīng),還可導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,從而造成組織結(jié)構(gòu)不完整形成損傷。TLR2受體在金黃色葡萄球菌感染后除可調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路外,還可對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)。為從蛋白水平揭示硒對(duì)凋亡信號(hào)通路的影響,采用Western Blot技術(shù)對(duì)PI3K/AKT/Bcl-2信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。奶牛乳腺上皮細(xì)胞分5組,以不添加硒和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞作為對(duì)照組,以金黃色葡萄球菌刺激0.5h的細(xì)胞作為金黃色葡萄球菌感染組,以不同濃度的硒(2、4和8μM)預(yù)孵育12h并用金黃色葡萄球菌刺激0.5h的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,分別檢測(cè)TLR2、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax和cleavedCaspase-3的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,金黃色葡萄球菌刺激乳腺上皮細(xì)胞0.5h后,與對(duì)照組相比,顯著或極顯著提高TLR2的蛋白水平和AKT的磷酸化水平(p0.05 或p0.001),極顯著提高了 Bax/Bcl-2 的比值(p0.001),極顯著增加了 Caspase-3的裂解(p0.001),啟動(dòng)了凋亡程序;與金黃色葡萄球菌感染組相比,8μM的硒能顯著降低TLR2的蛋白水平(p0.05),同時(shí)8μM的硒能極顯著提高AKT的磷酸化水平(p0.01),2、4和8μM的硒能極顯著降低Bax/Bcl-2的比值(p0.001),進(jìn)而極顯著的抑制Caspase-3裂解啟動(dòng)細(xì)胞死亡程序(p0.001),很好地保護(hù)了細(xì)胞。綜上所述,硒可以通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的水平和抑制細(xì)胞凋亡程序來(lái)發(fā)揮抗氧化、保護(hù)細(xì)胞和抑菌的作用。同時(shí)為奶牛乳腺炎的預(yù)防提供了基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)和新方向。希望本研究結(jié)果為硒在獸醫(yī)臨床應(yīng)用及金黃色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的防治藥物的開(kāi)發(fā)提供理論指導(dǎo)及幫助。
【圖文】：

圖１－１金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響逡逑母相同表示差異不顯著（ｐ〉０．０５），字母相鄰表示差異顯著（＾＜0．Ｆｉｇ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｍｅａｎ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋（／？＞０．０５），邋Ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋

２８邐揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文逡逑圖１－２金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ＬＤＨ的影響逡逑注：表示與Ｏｈ組相比差異極顯著0？＜０．０１），“＊＊＊”表示與對(duì)照組相比（ｐ＜０．００１）。逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ＬＤＨ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑Ｎｏｔｅ：邐ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｏｈ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑３．３金葡菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的ＲＯＳ水平的影響逡逑按ＭＯＩ＝ｌ邋：邋１的比例接種金黃色葡萄球菌，分別于０、１、２、４、６、８、１０、和１２ｈ后，逡逑采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平。結(jié)果如圖１－３所示，逡逑當(dāng)金黃色葡萄球菌侵襲ＢＭＥＣｓ時(shí)，０？２ｈ內(nèi)，ＲＯＳ水平與對(duì)照組相比差異不顯著0？＞０．０５），逡逑從４ｈ開(kāi)始，ＲＯＳ水平升高，，差異顯著0？＜０．０５），當(dāng)侵襲時(shí)間達(dá)到８ｈ時(shí)，ＲＯＳ水平達(dá)到峰逡逑值，８ｈ以后ＲＯＳ水平下降，差異顯著（ｐ＜０．０５）。逡逑１０－．逡逑３－邐｜逡逑Ｓ邐６－邐Ｉ逡逑運(yùn)邐＾邐ｂ逡逑Ｏ邐４－邐＋‘谷翕。逡逑＿１■攀乻邋Ｍ■‘逡逑０邐１邐２邐４邐６邐８邐１０邐１２邐２４逡逑時(shí)間（ｈ）逡逑圖１－３金黃色葡萄球菌對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)ＲＯＳ水平的影響逡逑注：字母相同表示差異不顯著（／７＞ａ0５），字母相鄰表示差異顯著（ｐ＜０．０５）。逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ｏｎ邋ＲＯＳ邋ｉｎ邋ＢＭＥＣｓ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ｓａｍｅ邋ｌｅｔｔｅｒｓ邋ｍｅａｎ邋ｎｏ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋（ｐ＞０．０５）
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：S858.23

【參考文獻(xiàn)】

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1 曹星梅;宋現(xiàn)濤;黃榕

本文編號(hào)：2551228