發(fā)布時間：2019-10-21 09:03

【摘要】：小腸上皮細胞表面TLR4(Toll like receptor,TLR4)受體在介導脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)引起的腸道炎癥反應及維持胃腸道免疫平衡中發(fā)揮著重要作用。在由炎癥反應引起的病理學變化中,TWEAK-Fn14通路起著關鍵的調(diào)節(jié)作用,然而對胃腸道中TLR4和TWEAK/Fn14信號通路的互作機制了解甚少。TWEAK在多種淋巴細胞中表達,包括單核巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、DC和嗜中性粒細胞。Fn14表達在多種組織細胞中,包括間質(zhì)細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞等。本研究旨在探索炎癥狀態(tài)下,TLR4和TWEAK/Fn14信號通路在仔豬小腸上皮細胞中潛在的互作機制。獲得研究結(jié)果如下:1.采集健康0d、7d、33d、55d及LPS處理55d齡仔豬的小腸組織,通過免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)TWEAK在0d、7d、33d健康仔豬小腸絨毛中弱染分布于央乳糜管,在55d健康仔豬強染分布于小腸黏膜固有層。Fn14主要在0d、7d、33d、55d健康仔豬小腸組織上皮細胞層弱染。相比較于同日齡正常對照組,LPS處理55d仔豬小腸組織可見TWEAK弱染以及Fn14強染。qRT-PCR、Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)LPS處理小腸組織中TWEAK和Fn14 mRNA及蛋白表達水平與IF檢測結(jié)果基本一致,同時表明TLR4的表達情況與Fn14表達趨勢基本一致。將LPS刺激體外培養(yǎng)仔豬小腸粘膜上皮細胞系(ZYM-SIEC02),通過qRT-PCR、Western Blot法檢測表明,Fn14和TLR4的表達水平均隨LPS作用劑量呈依賴性上升。同時,分別用anti-Fn14、anti-TLR4與LPS共同作用ZYM-SIEC02,通過Western Blot檢測表明LPS作用細胞中TLR4與Fn14表達水平呈正相關性,Fn14表達依賴于TLR4表達。2.為進一步研究TWEAK-Fn14通路與TLR4相關通路在仔豬小腸上皮細胞炎癥反應中的互作機制,我們首先采用anti-TNFα阻斷LPS刺激仔豬小腸黏膜上皮細胞系ZYM-SIEC02產(chǎn)生的TNF-α,Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)Fn14表達水平下降,TLR4表達水平?jīng)]有變化。提示LPS刺激上皮細胞產(chǎn)生的TNF-α對Fn14表達水平具有正向調(diào)節(jié)作用。其次,通過anti-Fn14阻斷及siRNA法發(fā)現(xiàn),Fn14表達沉默可顯著抑制LPS作用細胞中TNF-α表達水平,同時伴隨MyD88及NF-κB p65表達水平降低,提示Fn14通過TLR4下游MyD88-NF-κB p65通路顯著增強TLR4介導的炎癥作用。為研究TWEAK在仔豬小腸上皮細胞炎癥中的調(diào)節(jié)作用,將重組TWEAK蛋白作用LPS刺激后的仔豬小腸粘膜上皮細胞系,Western Blot檢測表明:TWEAK對LPS作用細胞中Fn14、MyD88、NF-κB p65與TNF-α表達水平呈劑量依賴性抑制作用。此外,Western Blot及激光共聚焦檢測表明,LPS作用可顯著抑制上皮細胞中緊密連接蛋白Occludin表達水平,而重組TWEAK蛋白對LPS作用細胞中Occludin表達呈現(xiàn)劑量依賴性增強作用。綜上所述,本研究通過LPS誘導的仔豬小腸上皮細胞炎癥模型,表明TLR4介導產(chǎn)生的TNF-α對上皮細胞中Fn14表達水平具有正向調(diào)節(jié)作用,而Fn14通過MyD88-NF-κB p65通路增強細胞中TLR4介導的炎癥反應,從而形成正反饋調(diào)節(jié)通路循環(huán);TWEAK在抑制Fn14受體表達及調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)下小腸上皮細胞中免疫水平及緊密連接蛋白Occludin表達中發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應和腫瘤等疾病，在其中識別受體（PRRs）的細胞識別微生物后激活，誘刺激分子的表達，從而激活 T 細胞，使天然免疫與h 1999; Akira and Hemmi 2003）。如圖 1-1 所示，白（LPS binding protein, LBP）直接結(jié)合，LBP 向 TLR4/MD-2 受體復合物轉(zhuǎn)移，來調(diào)節(jié) LPS 的識號通路的傳導有兩條途徑，分別為 TIRAP-MyDeda 2004; Kawai and Akira 2010）。TIRAP-MyD8關促炎細胞因子產(chǎn)生，TRIF-TRAM 途徑調(diào)節(jié)晚-β regulatory factor 3，，IRF3）活化。近期研究表明TJP）增加，是通過 TLR4/FAK/MyD88 信號轉(zhuǎn)導傷也是依賴通過TLR4/FAK/MyD88信號轉(zhuǎn)導途徑多種細胞因子和趨化因子的表達，包括 IL-2、IL應的重要調(diào)節(jié)因子。因此，TLR4/NF-kB 通路在炎
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S828

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本文編號：2551334