【摘要】：小腸上皮細(xì)胞表面TLR4(Toll like receptor,TLR4)受體在介導(dǎo)脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)引起的腸道炎癥反應(yīng)及維持胃腸道免疫平衡中發(fā)揮著重要作用。在由炎癥反應(yīng)引起的病理學(xué)變化中,TWEAK-Fn14通路起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,然而對(duì)胃腸道中TLR4和TWEAK/Fn14信號(hào)通路的互作機(jī)制了解甚少。TWEAK在多種淋巴細(xì)胞中表達(dá),包括單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、DC和嗜中性粒細(xì)胞。Fn14表達(dá)在多種組織細(xì)胞中,包括間質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。本研究旨在探索炎癥狀態(tài)下,TLR4和TWEAK/Fn14信號(hào)通路在仔豬小腸上皮細(xì)胞中潛在的互作機(jī)制。獲得研究結(jié)果如下:1.采集健康0d、7d、33d、55d及LPS處理55d齡仔豬的小腸組織,通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TWEAK在0d、7d、33d健康仔豬小腸絨毛中弱染分布于央乳糜管,在55d健康仔豬強(qiáng)染分布于小腸黏膜固有層。Fn14主要在0d、7d、33d、55d健康仔豬小腸組織上皮細(xì)胞層弱染。相比較于同日齡正常對(duì)照組,LPS處理55d仔豬小腸組織可見TWEAK弱染以及Fn14強(qiáng)染。qRT-PCR、Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS處理小腸組織中TWEAK和Fn14 mRNA及蛋白表達(dá)水平與IF檢測(cè)結(jié)果基本一致,同時(shí)表明TLR4的表達(dá)情況與Fn14表達(dá)趨勢(shì)基本一致。將LPS刺激體外培養(yǎng)仔豬小腸粘膜上皮細(xì)胞系(ZYM-SIEC02),通過(guò)qRT-PCR、Western Blot法檢測(cè)表明,Fn14和TLR4的表達(dá)水平均隨LPS作用劑量呈依賴性上升。同時(shí),分別用anti-Fn14、anti-TLR4與LPS共同作用ZYM-SIEC02,通過(guò)Western Blot檢測(cè)表明LPS作用細(xì)胞中TLR4與Fn14表達(dá)水平呈正相關(guān)性,Fn14表達(dá)依賴于TLR4表達(dá)。2.為進(jìn)一步研究TWEAK-Fn14通路與TLR4相關(guān)通路在仔豬小腸上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的互作機(jī)制,我們首先采用anti-TNFα阻斷LPS刺激仔豬小腸黏膜上皮細(xì)胞系ZYM-SIEC02產(chǎn)生的TNF-α,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Fn14表達(dá)水平下降,TLR4表達(dá)水平?jīng)]有變化。提示LPS刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α對(duì)Fn14表達(dá)水平具有正向調(diào)節(jié)作用。其次,通過(guò)anti-Fn14阻斷及siRNA法發(fā)現(xiàn),Fn14表達(dá)沉默可顯著抑制LPS作用細(xì)胞中TNF-α表達(dá)水平,同時(shí)伴隨MyD88及NF-κB p65表達(dá)水平降低,提示Fn14通過(guò)TLR4下游MyD88-NF-κB p65通路顯著增強(qiáng)TLR4介導(dǎo)的炎癥作用。為研究TWEAK在仔豬小腸上皮細(xì)胞炎癥中的調(diào)節(jié)作用,將重組TWEAK蛋白作用LPS刺激后的仔豬小腸粘膜上皮細(xì)胞系,Western Blot檢測(cè)表明:TWEAK對(duì)LPS作用細(xì)胞中Fn14、MyD88、NF-κB p65與TNF-α表達(dá)水平呈劑量依賴性抑制作用。此外,Western Blot及激光共聚焦檢測(cè)表明,LPS作用可顯著抑制上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白Occludin表達(dá)水平,而重組TWEAK蛋白對(duì)LPS作用細(xì)胞中Occludin表達(dá)呈現(xiàn)劑量依賴性增強(qiáng)作用。綜上所述,本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)的仔豬小腸上皮細(xì)胞炎癥模型,表明TLR4介導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α對(duì)上皮細(xì)胞中Fn14表達(dá)水平具有正向調(diào)節(jié)作用,而Fn14通過(guò)MyD88-NF-κB p65通路增強(qiáng)細(xì)胞中TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),從而形成正反饋調(diào)節(jié)通路循環(huán);TWEAK在抑制Fn14受體表達(dá)及調(diào)節(jié)炎癥狀態(tài)下小腸上皮細(xì)胞中免疫水平及緊密連接蛋白Occludin表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。
【圖文】：

參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)和腫瘤等疾病，在其中識(shí)別受體（PRRs）的細(xì)胞識(shí)別微生物后激活，誘刺激分子的表達(dá)，從而激活 T 細(xì)胞，使天然免疫與h 1999; Akira and Hemmi 2003）。如圖 1-1 所示，白（LPS binding protein, LBP）直接結(jié)合，LBP 向 TLR4/MD-2 受體復(fù)合物轉(zhuǎn)移，來(lái)調(diào)節(jié) LPS 的識(shí)號(hào)通路的傳導(dǎo)有兩條途徑，分別為 TIRAP-MyDeda 2004; Kawai and Akira 2010）。TIRAP-MyD8關(guān)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，TRIF-TRAM 途徑調(diào)節(jié)晚-β regulatory factor 3，，IRF3）活化。近期研究表明TJP）增加，是通過(guò) TLR4/FAK/MyD88 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)傷也是依賴通過(guò)TLR4/FAK/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，包括 IL-2、IL應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。因此，TLR4/NF-kB 通路在炎
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828

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本文編號(hào)：2551334