【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的疾病,其具有急性,高傳染性,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,也威脅著人類健康。防控禽流感有效的途徑是疫苗,但由于禽流感病毒存在抗原容易變異的特性導致疫苗防控也存在局限性,所以研制更為有效的疫苗是大家共同關注與亟待解決的難題。表達外源蛋白的新功能植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)作為新型口服免疫制劑在禽流感等粘膜免疫相關疾病的防制中具有諸多優(yōu)勢。聚-γ-谷氨酸合成酶A(pgsA)是乳酸菌的表面展示原件,可將外源蛋白錨定在宿主菌表面。樹突狀細胞誘導肽(DC-targeting peptides,DCpeps)能特異性將抗原靶向樹突狀細胞,增強抗原遞呈能力。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)是一種粘膜佐劑,具有很好的應用前景。本實驗通過pgsA’表面展示元件將禽流感病毒高度保守蛋白HA2基因錨定于植物乳桿菌表面,加入免疫佐劑LTB序列與免疫誘導肽DCpep構建新功能型乳酸菌,并對構建的具有免疫增強功能的新型乳酸菌免疫效果進行評價,具體實驗結果如下:(1)pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB三組新功能型乳酸菌的構建構建重組質(zhì)粒pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,電轉入植物乳桿菌中,經(jīng)誘導表達后,通過免疫印跡(Western blotting)實驗檢測新功能型乳酸菌表達蛋白的大小與免疫反應原性;通過免疫熒光實驗檢測目的蛋白在菌體表面的表達。實驗結果:成功構建三組新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,Western blotting驗證表達蛋白均有反應原性,且免疫熒光實驗證明了目的蛋白通過pgsA’錨定于植物乳桿菌表面,為后期實驗奠定基礎。(2)新功能型乳酸菌的分子免疫機制研究將三組新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB按照免疫程序喂飼6周齡BALB/c小鼠。免疫結束后,通過流式細胞術檢測各免疫器官中T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖活化情況,酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測小鼠體內(nèi)HA2特異性IgG和粘膜免疫抗體SIgA及血清內(nèi)細胞因子含量。對小鼠攻毒后測量體重并計算體重丟失率、存活率。將小鼠肺部取樣進行病理切片制作觀察。以上實驗綜合結果顯示:新功能型乳酸菌可提高脾臟(SPL)、腸系膜淋巴結(MLNs)中CD3+CD8+T細胞數(shù)量及分泌細胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的CD3+CD4+T細胞水平,同時增強小鼠體內(nèi)CD3+CD8+IFN-γ+T細胞的活化,提高B220+IgA+B細胞水平、HA2特異性IgG和粘膜免疫抗體SIgA的水平及細胞因子分泌水平。攻毒后,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組小鼠體重在第7天達到最低,第8天起小鼠體重逐漸恢復,其余三組均在第8天體重下降達到最低,第9天起各組小鼠體重均逐漸恢復,最后趨于穩(wěn)定,control組、pSIP409-pgsA’組、pSIP409-pgsA’-HA2組、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組存活率分別為12.5%、12.5%、12.5%、25%、37.5%,新功能型乳酸菌組與control對照組和空載體組相比,體重丟失率低且體重恢復快、存活率也相對較高。肺部病理切片結果顯示:新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組肺組織形態(tài)完整,炎性病變最輕,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組肺組織形態(tài)較為完整,炎性病變較輕,pSIP409-pgsA’-HA2組抗病毒染能力較前兩組低但優(yōu)于對照組,三組新功能型乳酸菌免疫組與control對照組和空載體組相比可降低病毒對小鼠肺部病理損傷,緩解肺部炎性病變,對禽流感病毒的感染有一定免疫保護作用,且共表達增強組分(DCpep及LTB)的乳酸菌具有更好的免疫效果,其中佐劑分子LTB較樹突狀細胞靶向肽DCpep更為明顯。綜上所述,本實驗利用pgsA’將蛋白成功錨定于植物乳桿菌NC8表面,構建了三組表達H9N2亞型禽流感病毒HA2蛋白的新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB。結果顯示新功能型乳酸菌可刺激特異性IgG和SIgA抗體的產(chǎn)生,增強T、B淋巴細胞的活化,提高細胞和體液免疫水平,并可增強免疫力,為研制新型口服抗禽流感微生態(tài)制劑提供了依據(jù)。
【圖文】：

e-HA2 質(zhì)粒進行 PCR，，產(chǎn)物電。圖 1.1 pSIP409-pgsA’載體回收pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III markeFig. 1.1. Result of pSIP409-pgsA’pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III marke

質(zhì)粒雙酶切鑒定 pSIP409-pgsA’-HA產(chǎn)物電泳鑒定，在 6167bp 和 697bp 圖 1.3 pSIP409-pgsA’-HA2 質(zhì)粒λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2;Fig. 1.3 Result of pSIP409-pgsA’ -HA2λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.4

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 ;Effect of lactobacillus on the gut microflora and barrier function of the rats with abdominal infection[J];World Journal of Gastroenterology;2005年17期

相關碩士學位論文 前1條

1 蔡若鵬;基于pgsA作為表面展示元件的重組植物乳桿菌表達系統(tǒng)的構建及驗證[D];吉林農(nóng)業(yè)大學;2015年

本文編號：2544639