【摘要】：禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的疾病,其具有急性,高傳染性,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,也威脅著人類健康。防控禽流感有效的途徑是疫苗,但由于禽流感病毒存在抗原容易變異的特性導(dǎo)致疫苗防控也存在局限性,所以研制更為有效的疫苗是大家共同關(guān)注與亟待解決的難題。表達(dá)外源蛋白的新功能植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)作為新型口服免疫制劑在禽流感等粘膜免疫相關(guān)疾病的防制中具有諸多優(yōu)勢。聚-γ-谷氨酸合成酶A(pgsA)是乳酸菌的表面展示原件,可將外源蛋白錨定在宿主菌表面。樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)肽(DC-targeting peptides,DCpeps)能特異性將抗原靶向樹突狀細(xì)胞,增強(qiáng)抗原遞呈能力。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)是一種粘膜佐劑,具有很好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)通過pgsA’表面展示元件將禽流感病毒高度保守蛋白HA2基因錨定于植物乳桿菌表面,加入免疫佐劑LTB序列與免疫誘導(dǎo)肽DCpep構(gòu)建新功能型乳酸菌,并對(duì)構(gòu)建的具有免疫增強(qiáng)功能的新型乳酸菌免疫效果進(jìn)行評(píng)價(jià),具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB三組新功能型乳酸菌的構(gòu)建構(gòu)建重組質(zhì)粒pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,電轉(zhuǎn)入植物乳桿菌中,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,通過免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)檢測新功能型乳酸菌表達(dá)蛋白的大小與免疫反應(yīng)原性;通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測目的蛋白在菌體表面的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:成功構(gòu)建三組新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB,Western blotting驗(yàn)證表達(dá)蛋白均有反應(yīng)原性,且免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了目的蛋白通過pgsA’錨定于植物乳桿菌表面,為后期實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。(2)新功能型乳酸菌的分子免疫機(jī)制研究將三組新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB按照免疫程序喂飼6周齡BALB/c小鼠。免疫結(jié)束后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各免疫器官中T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖活化情況,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)方法檢測小鼠體內(nèi)HA2特異性IgG和粘膜免疫抗體SIgA及血清內(nèi)細(xì)胞因子含量。對(duì)小鼠攻毒后測量體重并計(jì)算體重丟失率、存活率。將小鼠肺部取樣進(jìn)行病理切片制作觀察。以上實(shí)驗(yàn)綜合結(jié)果顯示:新功能型乳酸菌可提高脾臟(SPL)、腸系膜淋巴結(jié)(MLNs)中CD3+CD8+T細(xì)胞數(shù)量及分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的CD3+CD4+T細(xì)胞水平,同時(shí)增強(qiáng)小鼠體內(nèi)CD3+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞的活化,提高B220+IgA+B細(xì)胞水平、HA2特異性IgG和粘膜免疫抗體SIgA的水平及細(xì)胞因子分泌水平。攻毒后,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組小鼠體重在第7天達(dá)到最低,第8天起小鼠體重逐漸恢復(fù),其余三組均在第8天體重下降達(dá)到最低,第9天起各組小鼠體重均逐漸恢復(fù),最后趨于穩(wěn)定,control組、pSIP409-pgsA’組、pSIP409-pgsA’-HA2組、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組存活率分別為12.5%、12.5%、12.5%、25%、37.5%,新功能型乳酸菌組與control對(duì)照組和空載體組相比,體重丟失率低且體重恢復(fù)快、存活率也相對(duì)較高。肺部病理切片結(jié)果顯示:新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-LTB組肺組織形態(tài)完整,炎性病變最輕,新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep組肺組織形態(tài)較為完整,炎性病變較輕,pSIP409-pgsA’-HA2組抗病毒染能力較前兩組低但優(yōu)于對(duì)照組,三組新功能型乳酸菌免疫組與control對(duì)照組和空載體組相比可降低病毒對(duì)小鼠肺部病理損傷,緩解肺部炎性病變,對(duì)禽流感病毒的感染有一定免疫保護(hù)作用,且共表達(dá)增強(qiáng)組分(DCpep及LTB)的乳酸菌具有更好的免疫效果,其中佐劑分子LTB較樹突狀細(xì)胞靶向肽DCpep更為明顯。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)利用pgsA’將蛋白成功錨定于植物乳桿菌NC8表面,構(gòu)建了三組表達(dá)H9N2亞型禽流感病毒HA2蛋白的新功能型乳酸菌pSIP409-pgsA’-HA2、pSIP409-pgsA’-HA2-DCpep、pSIP409-pgsA’-HA2-LTB。結(jié)果顯示新功能型乳酸菌可刺激特異性IgG和SIgA抗體的產(chǎn)生,增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞的活化,提高細(xì)胞和體液免疫水平,并可增強(qiáng)免疫力,為研制新型口服抗禽流感微生態(tài)制劑提供了依據(jù)。
【圖文】：

e-HA2 質(zhì)粒進(jìn)行 PCR，，產(chǎn)物電。圖 1.1 pSIP409-pgsA’載體回收pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III markeFig. 1.1. Result of pSIP409-pgsA’pSIP409-pgsA’;M: λ-Hind III marke

質(zhì)粒雙酶切鑒定 pSIP409-pgsA’-HA產(chǎn)物電泳鑒定，在 6167bp 和 697bp 圖 1.3 pSIP409-pgsA’-HA2 質(zhì)粒λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2;Fig. 1.3 Result of pSIP409-pgsA’ -HA2λ-Hind III marker;1: pSIP409-pgsA’ -HA2
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Effect of lactobacillus on the gut microflora and barrier function of the rats with abdominal infection[J];World Journal of Gastroenterology;2005年17期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 蔡若鵬;基于pgsA作為表面展示元件的重組植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及驗(yàn)證[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2544639