【摘要】：牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis,M bovis)是一種導(dǎo)致牛結(jié)核病的典型胞內(nèi)病原菌,可跨物種傳播給人和其他哺乳動(dòng)物。在全球造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,并威及社會(huì)公共衛(wèi)生安全。近期,美籍華人科學(xué)家陳志堅(jiān)教授課題組發(fā)現(xiàn)了一種新型的DNA識(shí)別分子,環(huán)磷酸鳥苷-磷酸腺苷合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS),cGAS屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶成員,可特異性識(shí)別細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA,催化合成cGAMP,進(jìn)而依賴STING介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。長(zhǎng)期以來(lái)的研究都將巨噬細(xì)胞作為結(jié)核菌感染的主要宿主細(xì)胞,但隨著樹突狀細(xì)胞生理功能的逐步明了,其在結(jié)核菌感染中的作用越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)旨在探究小鼠髓源樹突狀細(xì)胞(murine bone marrow derived dendritic cell,BMDC)感染牛分枝桿菌后,cGAS 信號(hào)通路的表達(dá),以及對(duì)BMDC成熟及活化的調(diào)控,進(jìn)一步探究感染后CD4+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答,闡明相關(guān)作用機(jī)制。1.利用體外誘導(dǎo)的方法,原代分離BMDC,且純度達(dá)到90%以上。通過(guò)Western blot檢測(cè)感染后BMDC中cGAS及其下游相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,利用免疫熒光顯微鏡觀察IRF3的入核現(xiàn)象。結(jié)果顯示,感染后cGAS、p-TBK1的蛋白表達(dá)量上升,STING表現(xiàn)出雙條帶,IRF3入核現(xiàn)象明顯。而利用siRNA沉默cGAS后,下游相關(guān)蛋白表達(dá)均受到抑制,IRF3入核現(xiàn)象減弱。2.利用流式細(xì)胞術(shù)以及Ⅰ型干擾素受體阻斷劑,檢測(cè)感染后BMDC表面標(biāo)志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ的表達(dá)情況,利用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中IFN-β、IL-12p70、IL-10、IL-6、TNF-α的分泌情況。結(jié)果顯示,感染后表面標(biāo)志物表達(dá)量顯著上升,而cGAS沉默后以及Ⅰ型干擾素受體阻斷后,表達(dá)量均受到抑制。細(xì)胞因子的變化趨勢(shì)基本與之相同,但TNF-α不受阻斷劑的影響。添加外源性IFN-β后TNF-α、IL-12p70分泌量上調(diào),而IL-10、IL-6則無(wú)明顯變化。3.利用免疫磁珠方法從小鼠的脾臟特異性分離出CD4+T細(xì)胞,添加示蹤性熒光標(biāo)簽后,建立BMDC與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和ELISA技術(shù)分別檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的增殖情況以及IFN-γ的分泌。結(jié)果顯示,感染組可顯著誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的增殖,而阻斷Ⅰ型干擾素受體后擴(kuò)增能力下降。感染后IFN-γ表達(dá)量顯著上調(diào),而在阻斷組中則受到明顯抑制。綜上所述,本研究表明,cGAS信號(hào)通路存在于BMDC中,感染牛分枝桿菌后cGAS及下游相關(guān)蛋白可被激活,并且cGAS信號(hào)通路以及Ⅰ型干擾素途徑有助于BMDC表型的成熟和功能的活化,對(duì)抗原呈遞起到促進(jìn)作用。此外牛分枝桿菌感染BMDC后,可顯著增強(qiáng)CD4+T細(xì)胞的擴(kuò)增能力,提高IFN-γ的分泌量,誘發(fā)獲得性免疫應(yīng)答。
【圖文】：

在２０１５年，全球約６１０萬(wàn)新發(fā)病例，其中有１２．５萬(wàn)為多重耐藥（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ逡逑Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ－Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ邋Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，，邋ＭＤＲ－ＴＢ）病人，發(fā)病于中國(guó)、俄羅斯聯(lián)邦、印度尼西亞、逡逑印度、尼日利亞五國(guó)的ＭＤＲ－ＴＢ患者占到６０％以上，且ＭＤＲ－ＴＢ的成功治愈率只有５２％（圖１－１邋）。逡逑中國(guó)作為世界人口大國(guó)，長(zhǎng)久以來(lái)就是結(jié)核病氋負(fù)擔(dān)國(guó)，ＷＨＯ預(yù)計(jì)在２０１６－２０２０年，中國(guó)將是逡逑ＴＢ、ＭＤＲ－ＴＢ、ＴＢ與ＨＩＶ混感的高負(fù)擔(dān)國(guó)家（圖１－２）邋［２］。結(jié)核菌正表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒力和耐藥性。逡逑由于抗生素的長(zhǎng)期濫用導(dǎo)致多重耐藥性結(jié)核和廣泛耐藥性結(jié)核的出現(xiàn)，對(duì)新藥的研發(fā)不斷提出挑逡逑戰(zhàn)，對(duì)公共衛(wèi)生的安全有著深遠(yuǎn)影響［３；４］。因此，深入了解結(jié)核的流行狀況、致病機(jī)理、發(fā)病特逡逑點(diǎn)對(duì)今后有效的開展相關(guān)的預(yù)防控制和治療策略極為關(guān)鍵。逡逑動(dòng)物源性結(jié)核病最初發(fā)生于牛，所以又被稱為牛結(jié)核。牛分枝桿菌是牛結(jié)核的主要致病菌，逡逑屬于結(jié)核分枝桿菌屬成員１５］。牛分枝桿菌可同時(shí)傳播于野生動(dòng)物、家畜和人類之間，具有重大的逡逑公共衛(wèi)生學(xué)意義［６］。動(dòng)物性結(jié)核直接影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能和相關(guān)產(chǎn)品，以及國(guó)際進(jìn)出口貿(mào)易，具逡逑有極氋的經(jīng)濟(jì)相關(guān)性［７；８］？世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Ｏｆｆｉｃｅ邋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋ＤｅｓＥｐｉｚｏｏｔｉｅｓ

該酶的作用效應(yīng)依賴于煙憸胺腺嘌呤二核苗酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ邋Ａｄｅｎｉｎｅ邋Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，逡逑ＮＡＤＨ）邋［７４］。雖然上述基因及其產(chǎn)物表現(xiàn)出了對(duì)活性氮和活性氧中間產(chǎn)物一定的抵抗作用，但這逡逑些物質(zhì)發(fā)揮作用的機(jī)制有待進(jìn)一步的研宄（圖１－８）。逡逑丨＊ＷＷＷ丨丨逡逑Ｉ邋？ｍｍｒｎｍｍｍ＇邐｜邋ＭａｒｔｌＡＭ邋５，ｅｃｒｅ１ｅ＜ｌ邋ｂｙ邋Ｍ．邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ逡逑＼邋ｗ邐Ｉ邋Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ逡逑ｒａｆｔｓ逡逑Ｔ？ｌｈ？ｒｉｎ？ｇ邋ａｎｄ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ａｇ＃ｒ？ｔｓ逡逑？邋Ａｆ．邋ｔｕ＆ｅｔｅｉｔｋｒｓｉｓ邋ＭａｎＬＡＲｌ逡逑，．邐＾ｉ邐？邋ｖｐｓ？逡逑Ｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ邋Ｑｉｙｃｏ％ｙｉ９ｔｅａ邋Ｐ＼－ＳＰ邋ｍｉ邋ｉ邋＃邐＾邐邋Ｑ邋ｃｅａｉ逡逑在：？邋＾逡逑－0—逡逑＼ｙ－，邐今ＮＡＨＥ邋ｐｍｔｅｓｎｓ逡逑圖１－７邋Ｍｔｂ抑制吞噬溶酶體融合及吞噬體成熟逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－７邋Ｍｔｂ邋ｉｎｈｉｂｉｔ邋ｐｈａｇｏｌｙｓｏｍｅ邋ｆｕｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｍａｔｕｒｅ逡逑（弓邋Ｉ邋自邋Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ邋ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：邋Ｉｍｍｕｎｅ邋ｅｖａｓｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，邋Ａｎｔｉｍａ邋Ｇｕｐｔａ邋ｅｒ．ａ／，邋２０１２邋）逡逑－１０－逡逑
【學(xué)位授予單位】：寧夏大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 易敏;周向東;李升錦;陳維賢;;結(jié)核分枝桿菌EIS基因抑制人肺腺癌A549細(xì)胞自噬[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2013年02期

2 師長(zhǎng)宏;江鷹;趙勇;毛峰峰;張彩琴;白冰;張海;;結(jié)核分枝桿菌Hsp16.3蛋白影響小鼠巨噬細(xì)胞自噬形成的實(shí)驗(yàn)研究[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2011年12期

本文編號(hào)：2544527