【摘要】：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)誘發(fā)的乳腺炎一直是抗乳腺炎機理研究中較為復(fù)雜且重要的部分。其在臨床上多呈慢性、亞臨床性、反復(fù)性發(fā)病,給奶山羊養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在抗乳腺炎的研究中,乳腺特異性細(xì)菌誘導(dǎo)系統(tǒng)致力于抗菌蛋白在乳腺中的病理可調(diào)控性,能夠兼顧動物乳腺不同生理時期的對病原抵抗力特征狀態(tài)。白介素-1β(Interlukin-1,IL-1β)作為乳腺炎早期大量表達(dá)的細(xì)胞因子之一,在S.aureus誘發(fā)乳腺炎中扮演重要角色,其啟動子可作為細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的重要候選。160 bp的牛β酪蛋白增強子(bovineβ-casin enhancer,BCE)含有響應(yīng)催乳素和乳腺細(xì)胞外基質(zhì)的應(yīng)答元件,能夠特異性增加外源基因在乳腺中的表達(dá)。因此,二者結(jié)構(gòu)的有效組合和功能互補對構(gòu)建細(xì)菌誘導(dǎo)乳腺特異性表達(dá)系統(tǒng)具有重大意義。本實驗通過對山羊IL-1β啟動子區(qū)域的多物種比對并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)的報道,初步預(yù)測出了兩段近緣物種同源性較高的重要功能區(qū)域——遠(yuǎn)端增強區(qū)(-4161/-3653)和近端轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(-651/+85)。并以高保真重疊延伸PCR的方法成功克隆出了山羊IL-1β4582bp的啟動子區(qū)(包含部分CDS區(qū))與688bp的第一內(nèi)含子區(qū)。實驗通過構(gòu)建雙熒光素酶報告載體,以5’端選擇性截短的方式初步探討了金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)下山羊IL-1β啟動子不同區(qū)域在293T細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7和小鼠乳腺上皮細(xì)胞系HC11三種細(xì)胞中的活性以及BCE對356bp的遠(yuǎn)端增強區(qū)的增強作用的位置效應(yīng)。實驗結(jié)果表明包含潛在NF-κb結(jié)合位點的IL-1β遠(yuǎn)端增強區(qū)(-3911/-3555)對其他啟動子片段具有非組織依賴的增強作用。實驗通過將其下游依次插入近端啟動子區(qū)(-560/+5)和第一內(nèi)含子區(qū)(+801/+1489)能夠有效響應(yīng)金黃色葡萄球菌的誘導(dǎo),而缺失遠(yuǎn)端增強區(qū)或第一內(nèi)含子區(qū)任一部分則不能響應(yīng)該誘導(dǎo)作用。因此山羊IL-1β啟動子金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)活性的實現(xiàn)可能是以上三者共同作用的結(jié)果。BCE能夠增強不同啟動子在293T細(xì)胞和HC11細(xì)胞中的本底活性,但不同程度削弱了啟動子對金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的靈敏性。將牛BCE插入IL-1β遠(yuǎn)端增強區(qū)和近端啟動子之間,啟動子的活性下降,說明其對IL-1β遠(yuǎn)端增強區(qū)增強作用具有阻斷效應(yīng),反之插入IL-1β遠(yuǎn)端增強區(qū)上游,則能夠與IL-1β遠(yuǎn)端增強區(qū)共同增強近端啟動子的啟動活性。通過以上實驗成果,探究了山羊IL-1β啟動子區(qū)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的響應(yīng)模式以及BCE與對山羊IL-1β啟動子誘導(dǎo)活性的影響,為金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)的機理研究奠定了基礎(chǔ),并為構(gòu)建金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)型乳腺特異性表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建提供了思路。
【圖文】：

圖 1-1 S.aureus 入侵 MEC 的不同的受體機制(Alvamurillo et al.2014)a）S.aureus 通過 FnBPs 通過 Fn 作為一個連接分子結(jié)合 α5β1 整合素宿主受體介導(dǎo)的細(xì)b）FnBPs 采用未知機制，通過 HSP60 與整合素和或整合素作為輔助受體通過 Fn 橋直接c）的 S.aureus 鐵調(diào)節(jié)表面決定簇 B（ISDB）的 RGD 配體基序與整合素結(jié)合，內(nèi)吞途d）TLR2 參與 S.aureus 的內(nèi)化。CD36 作為輔助受體，識別而酰甘油酯的輔助受體，而聚體識別不同 PAMPs，如 LTA 和 SitC。在單核細(xì)胞 TLR2 定位與 LTA 在早期內(nèi)涵體eLa 細(xì)胞中，通過 CD36 內(nèi)化于 S.aureus。（e）宿主分子伴侶熱休克蛋白直接結(jié)合的自 S.aureus 的內(nèi)化，但細(xì)胞內(nèi)吞途徑仍然未知。igure 1．1: Different receptors and mechanisms involved in S. aureus internalization into nhagocytic cells. (a) The first mechanism described for S. aureus internalization involved theost receptor and is mediated by bacterial FnBPs via Fn as a linking molecule. (b) FnBPs interaost Hsp60 or with integrin and Hsp60 as a coreceptor through a Fn bridge, but the mechanismemains unknown. (c)The S. aureus iron-regulated surface determinant-B (IsdB) contributed tosdB most likely interacts with integrins that bind ligands with the RGD motif; however

洗脫液掛在吸附柱側(cè)壁上，于室溫靜置 1 min。離心機中 9000 ×g 離心 1 min。將提取的質(zhì)粒送至西京測序公司等待測序驗證。2.3 實驗結(jié)果2.3.1 山羊 IL-1β 啟動子區(qū)的預(yù)測近端核心啟動子為所有參與 RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的因子活動的最終靶標(biāo)，對轉(zhuǎn)錄的起始有著重要作用，在人，小鼠，虹鱒魚上都有報道包含轉(zhuǎn)錄起始位點 500 bp 的近端啟動子序列就具有轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù) Tiehui 等人的研究結(jié)果，我們?nèi)允褂蒙鲜鲱A(yù)測上游增強區(qū)域的方法預(yù)測了近端核心啟動子序列，，通過比對我們發(fā)現(xiàn)了一段長為 700 bp 左右包含部分 CDS 區(qū)（+85），牛，綿羊，山羊和人相似度較高（相似度高達(dá) 90.5%）的核心啟動子序列，如圖 2-2 所示。該啟動子為一個含非典型 TATA box（CATAAA）的核心啟動子，位于 TSS 上游 300 bp 內(nèi)有兩個潛在 NF-κb 結(jié)合位點，較遠(yuǎn)端的 NF-κb 結(jié)合位點已在人和小鼠上驗證具有不同功能。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.27

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2543185