【摘要】：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)可引起仔豬腹瀉,嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡,給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。熱穩(wěn)定性腸毒素STa(heat-stable enterotoxin)是ETEC的關(guān)鍵毒力因子,將STa去毒后制成亞單位疫苗,該疫苗具有良好效果。但亞單位疫苗需要通過注射免疫,并且需要低溫保藏和運(yùn)輸,這不但使疫苗成本高也給使用帶來不便。因此,研制出能口服免疫并且常溫保藏和運(yùn)輸?shù)囊呙缡墙鉀Q該問題的良好方略。蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)MIL158菌株具有益生菌的特性,可用作微生態(tài)制劑,動(dòng)物口服安全,其芽胞體耐熱,可常溫保藏。S-層蛋白是可將外源蛋白展示到微生物細(xì)胞表面的良好載體。本研究利用S-層蛋白的表面展示功能和蠟樣芽胞桿菌芽胞的熱穩(wěn)定性能,構(gòu)建了表達(dá)ETEC STa類毒素的蠟樣芽胞桿菌重組菌株,測定了重組菌株對小鼠的免疫原性,從而為研制安全且能常溫運(yùn)輸和保藏的STa疫苗初步打下了基礎(chǔ)。1.插入法重組菌株的構(gòu)建及其對小鼠免疫原性的測定Overlap PCR合成STa類毒素基因msta(mutant sta),插入載體p BMB982-304中S-層蛋白基因ctc錨定序列slh(S-layer homology)后面的Xba I位點(diǎn),在ctc前面插入細(xì)胞壁錨定所必需的csa AB操縱元,獲得重組質(zhì)粒p CSA-S(csa-ctc-msta)。電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒入受體菌株MIL158,獲得重組菌株MIL158/p CSA-S。Western blotting檢測重組菌株表達(dá)了含STa的融合蛋白。用重組菌株免疫小鼠,用ELISA測定小鼠血清抗體OD450值,結(jié)果,重組菌株的檢測值顯著高于(P0.05)三個(gè)對照組(PBS組、MIL158無質(zhì)粒組和MIL158/p BMB982-304空質(zhì)粒組)。結(jié)果表明,重組菌株MIL158/p CSA-S免疫小鼠產(chǎn)生了STa抗體。2.替換法重組菌株的構(gòu)建及其對小鼠免疫原性的測定為了考察不同的融合基因構(gòu)建方式對小鼠免疫原性的影響,本研究又用替換法構(gòu)建了重組菌株。Overlap PCR擴(kuò)增mgfp-linker-msta、ctc-his-msta和ctc-msta-his基因,替換載體p BMB982-304中S-層蛋白ctc基因中部Xba I和Hinc II之間的序列,在ctc前插入細(xì)胞壁錨定所必需的操縱元csa AB,獲得重組質(zhì)粒p CSA-GS(csa-ctc-mgfp-linker-msta)、p CSA-HS(csa-ctc-his-msta)和p CSA-SH(csa-ctc-msta-his)。電轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒入MIL158,獲得三個(gè)重組菌株MIL158/p CSA-GS、MIL158/p CSA-HS和MIL158/p CSA-SH。用重組菌株免疫小鼠,用ELISA測定小鼠血清抗體OD450值,結(jié)果,三個(gè)重組菌株的檢測值均顯著高于對照組(P0.05)。結(jié)果表明,三個(gè)重組菌株免疫小鼠均產(chǎn)生了STa抗體。與插入法構(gòu)建方式相比,替換法重組菌株免疫后的OD450值顯著高于插入法(P0.05)。
【圖文】：

圖 1-2 蘇云金芽胞桿菌 CTC 菌株 S-層蛋白 ctc 基因和操縱元 csaAB 示意圖(Liu etal 2008a)Fig.1-2 diagram of S-layer protein ctc gene and its operon csaAB of Bacillus thuringiensis CTC（Liu et al 2008a）

16圖 2-2 重組質(zhì)粒 pCTC-S 和 pCSA-S 構(gòu)建流ess of constructing recombinant plasmids pC轉(zhuǎn)化與鑒定H5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備與質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化受態(tài)：從大腸桿菌 DH5α 平板挑取單菌00 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)；第二天取復(fù)蘇的
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.12

【參考文獻(xiàn)】

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1 郭小華;趙志丹;熊海容;;益生芽胞桿菌腸道微生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2010年12期

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本文編號(hào)：2543103