【摘要】：肌肉生長(zhǎng)抑素(Myostatin,MSTN)是對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)揮負(fù)調(diào)控的因子。生長(zhǎng)抑素(Somatostatin,SS)通過(guò)抑制生長(zhǎng)激素分泌,進(jìn)而抑制機(jī)體生長(zhǎng)。本研究應(yīng)用原核顯微注射MSTN和SS RNA干擾片段所制備的轉(zhuǎn)基因小鼠(分別簡(jiǎn)稱(chēng)MSTN轉(zhuǎn)基因鼠、SS轉(zhuǎn)基因鼠),應(yīng)用PCR法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠,觀察兩種轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)與繁殖性能,旨在了解轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳穩(wěn)定性和促生長(zhǎng)效果,探討生長(zhǎng)和繁殖的調(diào)控機(jī)制,并從生理生化指標(biāo)等方面分析轉(zhuǎn)基因小鼠的健康狀況。結(jié)果如下:(1)轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳穩(wěn)定性應(yīng)用PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠的陽(yáng)性率,發(fā)現(xiàn)MSTN轉(zhuǎn)基因小鼠F1、F2、F3代的陽(yáng)性率分別為66.7%(56/84)、47.2%(17/36)、43.8%(7/16);SS轉(zhuǎn)基因小鼠F1、F2、F3代的陽(yáng)性率分別為61.7%(29/47)、63.6%(14/22)、47.1%(8/17),表明所用轉(zhuǎn)基因小鼠可穩(wěn)定遺傳。(2)轉(zhuǎn)基因小鼠的健康狀況分別取兩種轉(zhuǎn)基因小鼠F1代出生后第10周的心、肝、脾、肺等臟器組織,進(jìn)行HE染色,觀察組織病理變化,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的組織沒(méi)有發(fā)生病理變化,生理生化指標(biāo)及臟器指數(shù)均在正常范圍內(nèi)波動(dòng),表明轉(zhuǎn)基因操作對(duì)后代的健康狀況沒(méi)有造成不良影響。(3)轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)性能MSTN轉(zhuǎn)基因小鼠各代在第1、3周時(shí)的體重比野生型小鼠分別提高25.3%、15.6%(P0.05);其中雄性小鼠F1、F2代在5、6、7、10周時(shí)體重比野生型雄性小鼠分別提高11.8%、10.6%、7.5%、9.7%(P0.05);雌性小鼠F1代在第5周時(shí)體重比野生型雌性小鼠提高10.8%(P0.01)。這些結(jié)果表明,干擾MSTN的表達(dá)可以促進(jìn)生長(zhǎng),且促生長(zhǎng)能力與生長(zhǎng)期有關(guān),生長(zhǎng)越快的時(shí)期促生長(zhǎng)作用越明顯。SS轉(zhuǎn)基因小鼠F1、F2、F3代與野生型小鼠的體重相比,增重差異不顯著(P0.05),表明SS對(duì)生長(zhǎng)的調(diào)控可能還有其他機(jī)制。(4)轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖性能與野生型相比,MSTN和SS的轉(zhuǎn)基因小鼠F1代的窩產(chǎn)仔數(shù)均降低(8.8vs.11.0;9.4vs.11.0)(P0.05),但離乳率沒(méi)有影響(97.4%vs.97.8%;95.5%vs.97.8%),推測(cè)干擾MSTN和SS的表達(dá),可能抑制卵泡的發(fā)育,但對(duì)小鼠泌乳性能沒(méi)有影響。(5)轉(zhuǎn)基因小鼠促生長(zhǎng)作用的機(jī)制通過(guò)測(cè)定MSTN轉(zhuǎn)基因小鼠F1代肌肉組織中MSTN m RNA表達(dá)和蛋白水平,發(fā)現(xiàn)MSTN m RNA表達(dá)明顯下降,在第3、10周時(shí),在脛骨前肌中分別下調(diào)45%、65%(P0.01);在第10周時(shí),在腓腸肌中下調(diào)20%(P0.05);此外MSTN蛋白表達(dá)量在第3、10周時(shí)均下調(diào);血清中MSTN激素水平也下降,且在第10周時(shí)明顯降低(P0.01)。同樣地,Leptin m RNA表達(dá)量在第3周時(shí)降低44.2%(P0.05),血清中Leptin水平也下降,特別在第10周時(shí)下降最明顯(P0.01)。肌纖維形態(tài)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),肌纖維密度在第3周時(shí)增加31.9%(P0.05);肌纖維橫截面積與直徑在第10周時(shí)分別增大21.0%(P0.05)和8.5%(P0.05)。此結(jié)果表明,干擾MSTN的表達(dá),能有效降低MSTN和Leptin的表達(dá)與分泌,促進(jìn)小鼠骨骼肌的生長(zhǎng)并抑制脂肪代謝,進(jìn)而促進(jìn)小鼠體重增加,最終促進(jìn)小鼠的生長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)定SS轉(zhuǎn)基因小鼠F1代胃、腸、腦組織中SS m RNA表達(dá)和蛋白水平,發(fā)現(xiàn)SS轉(zhuǎn)基因小鼠各種組織中,SS m RNA表達(dá)和蛋白水平下降不明顯;但SS激素水平下降,且在第10周時(shí)差異極顯著(P0.01);GH激素水平上升,且在第3、6周時(shí)差異顯著(P0.05)。此結(jié)果表明,干擾SS的表達(dá),能顯著降低SS激素水平,進(jìn)而促進(jìn)GH激素水平,但為何對(duì)小鼠的促生長(zhǎng)作用不明顯,尚待進(jìn)一步研究。綜上所述,MSTN轉(zhuǎn)基因小鼠具有遺傳穩(wěn)定性且健康狀況良好,體內(nèi)干擾MSTN后,能抑制MSTN的表達(dá)與分泌,進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)。SS轉(zhuǎn)基因小鼠雖然具有遺傳穩(wěn)定性和安全性,但促生長(zhǎng)效果不明顯。本研究可為今后生產(chǎn)優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因大動(dòng)物提供理論參考并奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

RNA 干擾 MSTN 和 SS 轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)與繁殖性能及健康狀況評(píng)價(jià)將 siRNA 導(dǎo)入生物機(jī)體內(nèi)，能在全身各細(xì)胞中抑制靶基因的表達(dá)，這是 RNAi 技術(shù)的重要進(jìn)展。用顯微注射可以使表達(dá) siRNA 載體進(jìn)入動(dòng)物卵細(xì)胞中，來(lái)制備轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物（Kunath et al2003），或?qū)в?shRNA 編碼序列的重組慢病毒感染動(dòng)物早期胚胎來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（Tiscornia et al2003）。Golding 等人用干擾技術(shù)抑制 PRN的表達(dá)水平，并獲得轉(zhuǎn)基因羊胎兒，羊胎兒 PRNP 表達(dá)水平受到了抑制（Golding eal 2006）。在研究過(guò)程中經(jīng)常將轉(zhuǎn)基因小鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛣?dòng)物，，這與轉(zhuǎn)基因小鼠具有相對(duì)成本低，妊娠期短，基因易于改造的特點(diǎn)密切相關(guān)。

圖 1-2 RNA 干擾轉(zhuǎn)基因小鼠的制備（http://www.cyagen.com.cn）Fig. 1-2 The preparation of RNAi transgenic mice（http://www.cyagen.com.cn）.1.3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物健康狀況評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性主要考慮：環(huán)境、動(dòng)物本身和后代及其轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)品全性。在環(huán)境安全方面主要是為防止動(dòng)物的逃逸和基因的水平轉(zhuǎn)移而造成基因到自然界中，但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過(guò)隔離和加強(qiáng)管理來(lái)防止動(dòng)物的逃逸。有研發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬不會(huì)通過(guò)接觸等途徑進(jìn)行外源基因的水平轉(zhuǎn)移（Wheeler et al2010基因牛也不會(huì)發(fā)生上述水平轉(zhuǎn)移（Xu et al2011）。在動(dòng)物自身健康方面。由于基因的導(dǎo)入，可能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生潛在的影響，因此需要通過(guò)檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定性、繁殖性能及血常規(guī)等生理生化指標(biāo)來(lái)判斷動(dòng)物的健康狀況。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品方面需要進(jìn)行毒理、致敏性檢測(cè)等，從而保證轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性。目前轉(zhuǎn)基因動(dòng)安全性仍備受關(guān)注，如：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全的問(wèn)題，轉(zhuǎn)基因食品能否被端上餐
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S814.1

【參考文獻(xiàn)】

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3 張旭U

本文編號(hào)：2533110