【摘要】：狂犬病又稱(chēng)恐水病,是由狂犬病病毒引起的、迄今為止人類(lèi)唯一病死率幾乎高達(dá)100%的人畜共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病,嚴(yán)重威脅人們的生命安全。目前為止,狂犬病尚無(wú)有效的治療方法�？袢∫呙绲木o急預(yù)防接種是預(yù)防狂犬病病毒感染的最有效方法之一。目前,我國(guó)動(dòng)物使用的狂犬病疫苗主要是弱毒活疫苗。但由于弱毒苗存在毒力回復(fù)、突變等潛在的安全隱患問(wèn)題,WHO曾表明家養(yǎng)動(dòng)物不適合用弱毒苗免疫。所以,要防治狂犬病的發(fā)生重要的是研制出更安全有效的疫苗。腺病毒活載體疫苗因其自身的優(yōu)越性和應(yīng)用的廣泛性,已被應(yīng)用于狂犬病基因工程疫苗的研究。鞭毛蛋白是鞭毛的主要組成成分。它不僅在細(xì)菌運(yùn)動(dòng)方面起著重要作用,而且也可以與表達(dá)于上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞的頂端和基底外側(cè)的TLR5受體結(jié)合,從而誘導(dǎo)分泌前炎性因子和細(xì)胞因子,介導(dǎo)激活T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答。因此,鞭毛蛋白可以作為疫苗佐劑,增強(qiáng)疫苗的免疫效果,具有良好的應(yīng)用前景。本試驗(yàn)成功表達(dá)并純化了鞭毛蛋白FljB、FliC和FljB’-FliC。純化的蛋白與狂犬病毒滅活疫苗(whole-killed rabies vaccine,WKRV)一起免疫小鼠。小鼠共五組:((1)PBS;(2)WKRV;(3)WKRV和10μg FljB;(4)WKRV和10μg FliC;(5)WKRV和10μg FliB’-FliC。每組10只小鼠,每隔兩周進(jìn)行一次免疫,共免疫兩次。在免疫后0天、7天、14天、21天、28天和35天采血,通過(guò)ELISA的方法檢測(cè)抗體水平。用ELISPOT的方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的變化。抗體結(jié)果表明:FljB有望成為WKRV的佐劑;免疫了FliC后能夠提高免疫反應(yīng),但效果不明顯;FljB’-FliC不能提高WKRV的體液免疫反應(yīng)。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明:FljB誘導(dǎo)產(chǎn)生的Th1和Th2免疫反應(yīng)要強(qiáng)于FliC;FliB’-FliC不能增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。本試驗(yàn)采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了表達(dá)狂犬病毒G蛋白、G蛋白與鞭毛蛋白FljB和G蛋白與FliC的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-G、Ad-GB和Ad-GC。用重組腺病毒免疫BALB/c小鼠,每隔兩周免疫一次,共免疫三次。在免疫后0天、14天、28天、35天和42天采血,通過(guò)間接ELISA的方法檢測(cè)狂犬病毒G蛋白的抗體IgG水平。通過(guò)ELISPOT的方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ的變化。用FCM進(jìn)行了CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞的檢測(cè)�？贵w檢測(cè)結(jié)果表明:FljB和FliC均有增強(qiáng)體液免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明:FljB和FliC均有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用,并且FljB比FliC的效果好。FCM檢測(cè)結(jié)果表明:FljB和FliC均能夠增強(qiáng)誘導(dǎo)Th和Tc細(xì)胞的增殖。綜上所述,鞭毛蛋白FljB和FliC無(wú)論是在狂犬病毒滅活疫苗中還是在腺病毒共表達(dá)G蛋白和鞭毛蛋白的基因工程疫苗中,均有免疫增強(qiáng)作用。并且,FljB總體上來(lái)說(shuō)比FliC的增強(qiáng)效果更顯著。表明了FljB有望成為狂犬病疫苗的佐劑,從而為研制安全、高效的狂犬病疫苗提供一定的參考作用。
【圖文】：

現(xiàn)癥狀的人可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)檢測(cè)是否患狂犬病，比如，用直接熒光抗體檢測(cè)膚活檢樣本中的 RABV，用 RT-PCR 檢測(cè)唾液，用抗體檢測(cè)血清或腦脊液。對(duì)動(dòng)物樂(lè)死動(dòng)物的腦組織樣本可以通過(guò)直接熒光抗體檢測(cè)的方法來(lái)檢測(cè) RABV。除了在公工作的人，大多數(shù)人很難有機(jī)會(huì)進(jìn)行狂犬病檢測(cè)。然而，作為預(yù)防獸醫(yī)工作者，應(yīng)的診斷實(shí)驗(yàn)是有用的以及在診斷病毒時(shí)需要什么樣的樣本。記住一些關(guān)于狂犬病的的治療以及保護(hù)身邊人的安全都是很有幫助的。 狂犬病病毒研究 病毒粒子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)犬病病毒（rabies virus, RABV）是單股負(fù)鏈不分節(jié)段的 RNA 病毒，含有囊膜，屬(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬(Lyssavirus)，具有嗜神經(jīng)性( Mayo et al., 2006; Ros)。電鏡下觀察，RABV 成熟的病毒粒子直徑約 75 nm，不同的毒株病毒粒子長(zhǎng)度有約 170~180 nm，一端平凹，另一端鈍圓，形狀呈典型的子彈狀結(jié)構(gòu) ( King et al., 1-2 所示。病毒粒子由脂質(zhì)雙層外膜、基因組 RNA 和核蛋白、衣殼基質(zhì)蛋白、轉(zhuǎn)錄以及包膜基質(zhì)蛋白 5 種結(jié)構(gòu)蛋白組成。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言的排列順序?yàn)?3'-N-P-M-G-L-5'�；蚪M中約 91%的核苷酸編碼結(jié)構(gòu)蛋白，由 3′ 端 poly(A)～5′端 AACA 分別編碼病毒核蛋白（Nucleoprotein）、磷蛋白（phosphoprotein）、膜基質(zhì)蛋白（matrixprotein）、糖蛋白（glycoprotein）和依賴 RNA 的 RNA 多聚酶(RNA polymerase, L)( Tordo et al.,1998 )，基因長(zhǎng)度分別為 1424 bp，991 bp，804/805 bp，1675 bp、6475/6476 bp，對(duì)應(yīng)的 ORF 大小依次為 1353 bp，894 bp，609 bp，1575 bp，6429 bp ( 韋平等, 2008 )。RABV 編碼的五個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中糖蛋白(G)是存在病毒顆粒表面的唯一的蛋白質(zhì)，以三聚體形式存在，，可與細(xì)胞受體結(jié)合，是 RABV 的主要保護(hù)性抗原，能誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫的產(chǎn)生和刺激 T 細(xì)胞作用產(chǎn)生細(xì)胞免疫。當(dāng)前無(wú)論是人用狂犬病疫苗還是獸用疫苗的效價(jià)主要取決于疫苗制劑中糖蛋白的含量。RABV 和其他彈狀病毒的辨別有賴于非編碼區(qū)的差異( Wunner et al., 1988 )。病毒在感染宿主細(xì)胞后會(huì)在 3′端非編碼區(qū)產(chǎn)生一個(gè)由 58 個(gè)核苷酸組成的先導(dǎo)序列，該序列在復(fù)制過(guò)程中不翻譯；編碼核蛋白、磷蛋白、膜基質(zhì)蛋白、糖蛋白和依賴 RNA 的 RNA 多聚酶的各結(jié)構(gòu)基因之間含有不同長(zhǎng)度的不轉(zhuǎn)譯間隔區(qū)，間隔區(qū)大小分別為 2、5、5、423 nt( Wunner et al., 1988 )；在基因組的 5′端非編碼區(qū)是一個(gè) 70 個(gè)核苷酸組成的非轉(zhuǎn)錄序列（見(jiàn)圖 1-3）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2532213