【摘要】：A型魏氏梭菌是引起創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒的主要病原菌之一,α毒素是其主要的致病因子。α毒素是一種依賴于鋅離子具有磷脂酶C(PLC)活性的金屬酶,它具有酶分子的結(jié)構(gòu)特征,其活性部位包括催化位點和結(jié)合位點。α毒素第56位天冬氨酸(Asp)是鋅離子的結(jié)合位點,又是α毒素磷脂酶C的催化位點。國外研究結(jié)果初步證實,α毒素的某些氨基酸殘基對其具有的生物學(xué)活性至關(guān)重要,同時其氨基端具有磷脂酶C活性,但尚未開展α毒素的分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性之間關(guān)系的研究。為此,本研究主要開展α毒素催化位點上第56位Asp的定點突變及其氨基端plc基因表達、結(jié)構(gòu)分析和生物學(xué)特性研究。一方面,利用PCR定點突變技術(shù),將A型魏氏梭菌α毒素的第56位天冬氨酸(Asp-56)密碼子(GAT)定點突變成甘氨酸(Gly-56)密碼子(GGT),構(gòu)建了含α毒素D56G突變基因表達質(zhì)粒的重組菌株BL21(DE3)(p M-D56G)。通過酶切鑒定和序列分析所得結(jié)果可知,含有α毒素D56G突變基因的表達質(zhì)粒p M-D56G已成功構(gòu)建。經(jīng)SDS-PAGE分析,重組菌株BL21(DE3)(p M-D56G)中α毒素D56G突變體蛋白的表達量可達菌體總蛋白相對含量的22.48%。α毒素和α毒素D56G突變體蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測使用了EXPASY服務(wù)器上的SOPMA法,并同源模建它們的3D結(jié)構(gòu),結(jié)果兩者的二級結(jié)構(gòu)均由大量的α螺旋和無規(guī)則卷曲組成,兩者具有極其相似的3D結(jié)構(gòu)。利用圓二色(CD)光譜儀測定了α毒素和α毒素D56G突變體蛋白的CD光譜,結(jié)果兩者CD光譜只有一些極小的變化。生物學(xué)活性檢測結(jié)果表明,α毒素D56G突變體蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性。免疫攻毒試驗結(jié)果顯示,α毒素D56G突變體蛋白免疫能夠在1MLD的A型魏氏梭菌標準株C57-1的毒素作用下令小鼠存活。另一方面,利用PCR技術(shù)選擇性的將α毒素氨基端plc基因(PLC1-250)從A型魏氏梭菌α毒素基因中擴增出來,并將其導(dǎo)入重組質(zhì)粒BL21,從而構(gòu)建了含α毒素氨基端plc基因表達質(zhì)粒的重組菌株BL21(DE3)(p N-PLC)。通過酶切鑒定和序列分析結(jié)果證明,構(gòu)建的表達質(zhì)粒p N-PLC中含有α毒素氨基端plc基因。經(jīng)SDS-PAGE分析,重組菌株BL21(DE3)(p N-PLC)中α毒素氨基端PLC1-250蛋白的表達量為菌體總蛋白相對含量的18.76%。應(yīng)用EXPASY服務(wù)器上的SOPMA法對α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白分子進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和同源模建3D結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示,主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)。α毒素氨基端PLC1-250蛋白的3D結(jié)構(gòu)與α毒素氨基端部分相似。圓二色(CD)光譜分析α毒素和α毒素氨基端PLC1-250蛋白發(fā)現(xiàn),它們的CD光譜相似。對其生物學(xué)活性的檢測表明,α毒素氨基端PLC1-250蛋白依然保留了α毒素的磷脂酶C活性�？傊�,上述實驗結(jié)果為進一步研究A型魏氏梭菌α毒素基因工程亞單位疫苗和α毒素的分子作用機制提供理論和實驗依據(jù),對于闡明魏氏梭菌α毒素的致病機制具有重要理論意義和實踐價值。
【圖文】：

圖 1.1 表達質(zhì)粒 pM-D56G 的酶切 I; 2.pM-D56G 的 Nco I/EcoR I 酶切; 3.pM-D Nco I/BamH I/EcoR I 酶切; M. QDL2000 DNcation of the recombinant plasmid pM-D56G bycoR I; 2. pM-D56G+NcoI/EcoR I; 3.pM-D56GD56G+NcoI/BamH I/EcoR I; M. QDL2000 DN基因表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析毒素 D56G 突變體基因的重組菌株 BL 分析結(jié)果表明，α 毒素 D56G 突變體基凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，重組菌株 B達量占菌體總蛋白相對含量的 22.48%M 1 2 3

圖 1.1 表達質(zhì)粒 pM-D56G 的 I 酶切 I; 2.pM-D56G 的 Nco I/EcoR I 酶切; 36G 的 Nco I/BamH I/EcoR I 酶切; M. QDL20entification of the recombinant plasmid pM-D556G+EcoR I; 2. pM-D56G+NcoI/EcoR I; 3.pM. pM-D56G+NcoI/BamH I/EcoR I; M. QDL200變體基因表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析菌 α 毒素 D56G 突變體基因的重組菌株P(guān)AGE 分析結(jié)果表明，α 毒素 D56G 突變。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，，重組菌白表達量占菌體總蛋白相對含量的 22Da M 1 2 3
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

【共引文獻】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 韓廣偉;產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β_1、β_2、ε毒素蛋白的共表達及免疫原性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

本文編號：2530863