【摘要】：肌內(nèi)脂肪沉積的調(diào)控對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)效率具有重要的意義。肌內(nèi)脂肪的沉積影響著肉質(zhì)品質(zhì),了解脂肪在肌內(nèi)脂肪與皮下脂肪差異沉積的機(jī)制,通過提高肌內(nèi)脂肪沉積的同時(shí),不影響甚至減少皮下脂肪沉積,對(duì)于提高豬肉品質(zhì),降低經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)至關(guān)重要。核受體輔激活蛋白3(Nuclear receptor coactivator 3,NCOA3)是固醇類輔激活蛋白家族的一員,有實(shí)驗(yàn)證明,NCOA3通過與C/EBPδ和C/EBPα相互作用調(diào)控PPARγ2轉(zhuǎn)錄活性,在脂肪分化和代謝中發(fā)揮重要作用。為了研究皮下與肌內(nèi)脂肪組織的差異沉積機(jī)制,我們通過生物信息學(xué)分析,了解NCOA3的蛋白結(jié)構(gòu),通過構(gòu)建啟動(dòng)子缺失報(bào)告載體,分析NCOA3的啟動(dòng)子活性。同時(shí)比較皮下脂肪組織與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3的表達(dá)水平,并從甲基化表觀調(diào)控水平上尋找NCOA3在兩種組織中的表達(dá)差異機(jī)制,為特異性調(diào)控肌內(nèi)脂肪的沉積提供理論依據(jù)。結(jié)果如下:1豬NCOA3基因的生物信息學(xué)分析NCOA3基因mRNA含有4173bp的開放閱讀框,編碼1390個(gè)氨基酸,蛋白分子量為151.2kDa。不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu),具有極強(qiáng)的親水性及復(fù)雜的螺旋結(jié)構(gòu),但穩(wěn)定性不好,這可能與其結(jié)構(gòu)、功能的復(fù)雜性有關(guān)。通過比較人、鼠以及豬的NCOA3氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)三者具有極高的相似性(88.16%),因此可以基于NCOA3在人與鼠上的研究推測(cè)其對(duì)豬中脂肪分化的影響。2豬NCOA3基因5'側(cè)翼序列缺失報(bào)告載體的構(gòu)建與啟動(dòng)子活性分析構(gòu)建了豬的六個(gè)雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到PK15細(xì)胞和豬的肝細(xì)胞中檢測(cè)熒光活性。結(jié)果表明,豬NCOA3基因的核心啟動(dòng)子位于上游-150～-3bp之間,通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬的NCOA3基因啟動(dòng)子區(qū)只存在一個(gè)CpG島,且位于上游-930～-699bp。對(duì)其啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)在CpG島內(nèi)含有SP1、c-Jun、CREBP1、CEBPδ等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),其中SP1為甲基化敏感位點(diǎn)。推測(cè)CpG島可能影響NCOA3的啟動(dòng)子活性。3豬NCOA3基因CpG島甲基化水平與其表達(dá)水平利用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)比較皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪組織中NCOA3 mRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)NCOA43基因在肌內(nèi)脂肪組織中的表達(dá)量顯著低于其在皮下脂肪組織的表達(dá),兩者差異極顯著(P0.01)。同時(shí)采用亞硫酸鹽測(cè)序(BSP)方法檢測(cè)NCOA3基因CpG島的甲基化水平,發(fā)現(xiàn)該CpG島總體甲基化水平在皮下與肌內(nèi)脂肪組織中分別為83.5%和90%,但是差異不顯著(P=0.11)。對(duì)CpG島進(jìn)行單位點(diǎn)分析,結(jié)果表明-904位點(diǎn)甲基化程度在皮下與肌內(nèi)脂肪組織間差異顯著(P0.05),其中皮下脂肪的甲基化比例為20%,肌內(nèi)脂肪甲基化比例為55%。為檢測(cè)甲基化是否影響NCOA3基因的啟動(dòng)子活性,我們對(duì)NCOA3啟動(dòng)子進(jìn)行體外甲基化處理,發(fā)現(xiàn)甲基化轉(zhuǎn)移酶處理后啟動(dòng)子活性顯著下降(P0.05)。同時(shí)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)-904位點(diǎn)附近(-903～-894bp)有一C/EBPδ結(jié)合位點(diǎn),我們將該轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染測(cè)定熒光發(fā)現(xiàn),突變后啟動(dòng)子活性極顯著下降(P0.05)。由此推測(cè),啟動(dòng)子甲基化水平能夠影響NCOA3表達(dá)活性,-904位點(diǎn)組織間的甲基化水平差異可能影響C/EBPδ與NCO43啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合從而導(dǎo)致其在皮下和肌內(nèi)脂肪組織的差異表達(dá)。
【圖文】：

纖連蛋白、核也蛋白聚糖、骨粘連蛋白等）可Ｗ減少外部壓力的干擾，確保脂逡逑肪組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性Ｗ＂。除了細(xì)胞外基質(zhì)，生物體內(nèi)的白色脂肪組織由逡逑多種細(xì)胞組成如圖１，包含多種血管間充質(zhì)干細(xì)胞，如前體脂肪細(xì)胞、成纖維逡逑細(xì)胞、內(nèi)源性血管細(xì)胞、淋己細(xì)胞、巨嗟細(xì)胞Ｗ及其它的免疫細(xì)胞１７邋＂。其中前逡逑體脂肪細(xì)胞占總的白色脂肪組織的１５％－５０％，且在不同的脂肪沉積部位有不同逡逑的分化能力Ｗ。脂肪組織中的微血管提供足夠的養(yǎng)料Ｗ及氧氣確保足夠的激素、逡逑細(xì)胞因子的釋放Ｗ，如脂肪細(xì)胞通過內(nèi)分泌和旁分泌產(chǎn)生眾多脂肪因子，包括逡逑瘦素、脂聯(lián)素、炎癥因子等＂＂１＂，這些因子對(duì)于機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答反應(yīng)、血管性逡逑疾病和食欲調(diào)節(jié)等許多生物過程是必不可少的。例如，成熟脂肪細(xì)胞分泌的瘦逡逑素參與生物體含欲、含物吸收、體重調(diào)節(jié)和造血功能等重要生理功能１＂。月旨逡逑肪組織中這些微血管還與一些疾病如肥胖、膜島素抵抗有關(guān)，同時(shí)脂肪組織中逡逑包含的淋己管，它們對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)分泌的脂肪因子必不可少除調(diào)控生理代謝逡逑夕ｈ脂肪組織也為雌二醇生物合成與固醇類激素儲(chǔ)存提供場(chǎng)所ＷＷ。并且，，為逡逑了適應(yīng)能量?jī)?chǔ)存的改變

從前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化是由一個(gè)精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)調(diào)控，其逡逑通過多種轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路Ｗ及一些脂肪代謝酶等基因調(diào)控前體脂肪細(xì)胞向逡逑成熟脂肪細(xì)胞分化如圖２。其中b6餅是脂肪分化中最重要的兩個(gè)轉(zhuǎn)逡逑錄因子。逡逑Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ逡逑ｅｆｆｅｃｔｏ邋巧逡逑ＫＬＦｓ邋Ｃ／ＢＢＰ邐ＰＲＡＲｙ逡逑ＡＰ－１邋４ａｎｄＳ邋目六。Ｓ邋５邋屖５邐妼妼邋ＳＲＥＢＰ－１逡逑＼邋／邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋？逡逑—成沁巧一．邐＾１＾逡逑ＣｌｏａａＪ邋ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋巧＂ｐｉｄ邋ａｃｃｕｍｕ化Ｗｏｎ邋ａｎｄ邋化邋ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ邐？逡逑＇Ｉ．、邐￣＾邐？逡逑下、．．－４邋下邋下邐７＾邋下邐’．Ｖ．．．．．邋＃逡逑ＴＴ＼／逡逑ＫＬＦｓ邋Ｐ邋只邋ＥＦ．１逡逑ＧＡＴＡ邋２邋ａｎｄ邋７邐Ｗｎｔ．ｌＯｂ邐ｖＶｎｔ－５ａ逡逑２邋ａｎｄ邋３逡逑Ｉ邐Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｔｒａｎｆｓｃｒ＇ｐｔ邋0－＼ｓｌ＼邋｜逡逑Ｕ＂＇邐Ｉ逡逑圖２脂肪分化過程中主要的轉(zhuǎn)錄因子ｗ逡逑巧徑．２邋Ｔｈｅ邋ｋｅｙ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｆａｃｔｏｒｓ邋ｉｎ邋ａｄｉｐｏｃｙｔｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｌ３７］逡逑３逡逑
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828

【參考文獻(xiàn)】

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1 高媛;孫嬰寧;李輝;王寧;;DNA甲基化與脂肪組織生長(zhǎng)發(fā)育[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年09期

2 黃業(yè)傳;賀稚非;李洪軍;秦剛;王庭;馬明輝;;皮下脂肪和肌內(nèi)脂肪對(duì)豬肉風(fēng)味的作用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年10期

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1 劉健;DLY豬不同部位脂肪和肌肉組織基因組甲基化程度的差異[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2530505