【摘要】：鐵作為生物有機(jī)體中必需的微量元素之一,在細(xì)胞代謝和生物生長發(fā)育中起著重要的作用,比如,體內(nèi)氧的運(yùn)輸,電子的傳遞,細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖,但是,機(jī)體內(nèi)鐵過量會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基提升,從而引起蛋白和DNA的氧化損害,造成細(xì)胞和組織的死亡。生物體內(nèi)維持鐵平衡的蛋白家族主要是鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,其中轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的乳鐵蛋白同時作為抗菌活性肽在機(jī)體的免疫方面起著至關(guān)重要的作用。本研究從了解鐵蛋白家族和轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進(jìn)化及乳鐵蛋白在家族進(jìn)化過程中的產(chǎn)生和地位入手,將乳鐵蛋白作為抗菌活性肽在食品級乳酸菌中進(jìn)行表面表達(dá),以期獲得能夠應(yīng)用于飼料添加劑的高效活性益生菌,同時還對乳酸菌作為產(chǎn)乙醇菌耐受木質(zhì)纖維水解液抑制物進(jìn)行了探索。主要研究結(jié)果如下:1.鐵蛋白家族的進(jìn)化鐵蛋白家族成員廣泛分布在生物界中,而最典型的鐵蛋白作為看家基因,在動物、植物和微生物界都有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)選取了248個來自病毒、古菌、細(xì)菌和真核生物的1181條蛋白序列進(jìn)行研究,研究發(fā)現(xiàn)鐵蛋白基因在哺乳動物和雙子葉植物中大量存在,真菌中由于有其它鐵平衡系統(tǒng)而很少存在,細(xì)菌、古菌中的鐵蛋白基因也很可觀;其中在原核生物中有3中類型的鐵蛋白亞家族存在,而在真核生物中,只有典型的鐵蛋白亞家族存在,但是它是由多種類型的亞基組成;特征序列模體的分析表明,維持鐵結(jié)合和釋放功能的氨基酸殘基位點(diǎn)在生物進(jìn)化中是保守存在的,同時每個亞家族和亞基類型的特征序列模體是可區(qū)分的,特別是在植物鐵蛋白中發(fā)現(xiàn)了一個辨識度很高的特征模體;鐵蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,相同亞家族或亞基的鐵蛋白成員在進(jìn)化樹上是簇成一個進(jìn)化分支的,不同的亞家族或亞基產(chǎn)生的主要原因是基因復(fù)制事件的發(fā)生,同時基因漂移和基因丟失也是產(chǎn)生家族新成員的因素。2.轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的進(jìn)化轉(zhuǎn)鐵蛋白家族作為轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子維持鐵平衡的重要蛋白家族主要存在于動物中,同時在綠藻中也有發(fā)現(xiàn)。本試驗(yàn)選取了具有代表性的動植物的100個物種,共371條轉(zhuǎn)鐵蛋白基因進(jìn)行研究。研究表明,轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)基因在動物中廣泛分布,但是其基因數(shù)目和類型在不同的動物分類族群中有很大的區(qū)別。一般說來,哺乳動物中基因組中有大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白基因,而吸蟲類動物僅少數(shù)的基因存在。其中,黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(Melanotransferrin)和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(Serotransferrin)廣泛分布于脊椎動物,而類黑素轉(zhuǎn)鐵蛋白(Melanotransferrin-like)和I型類轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin-like 1)在所選非脊椎動物各物種中都有分布。本研究從少數(shù)幾個植物物種的基因組中首次推斷出轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)基因的存在,其分布在被子植物和蕨類植物中。通過比較其中6個重要家族成員的一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)7個高度保守的特征模體。進(jìn)化樹的構(gòu)建表明,基因復(fù)制、基因丟失以及基因漂移是推動轉(zhuǎn)鐵蛋白家族成員多樣性的重要原因,同時,本試驗(yàn)提出各家族成員可能經(jīng)歷的進(jìn)化事件。綜上所述,本研究的發(fā)現(xiàn)有助于更全面深入地了解轉(zhuǎn)鐵蛋白家族基因的分布、特征模體和殘基,及其家族的進(jìn)化進(jìn)程。3.乳鐵蛋白在食品級乳酸菌中的表面表達(dá)以乳鐵蛋白N端活性肽為目的基因,自溶素基因(acmA)作為細(xì)胞表面錨定結(jié)構(gòu)域,抗菌肽基因nisI作為食品級篩選標(biāo)記基因,利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建了pMG36-acmA-bLfcin-nisI穿梭表達(dá)載體,并將其電轉(zhuǎn)化進(jìn)入食品級乳酸乳球菌MG1614中,成功獲得陽性轉(zhuǎn)化子,通過測序結(jié)果證明成功構(gòu)建了含有表面錨定基因和食品級抗性基因的能高效表達(dá)乳鐵蛋白N端多肽的食品級乳酸乳桿菌MG1614(pMG36-acmA-bLfcin-nis I)。4.Lactobacillus casei 12AE1在合成水解液中發(fā)酵時對抑制物耐受性研究乳酸菌作為食品級菌株是酒精發(fā)酵生產(chǎn)中常見的易染菌,說明它耐受高濃度酒精、耐受水解液中pH的變化�；贚.casei 12AE1的酒精耐受性(10%的酒精濃度),碳源利用性和相對較高的電轉(zhuǎn)化效率,本研究主要對水解液中存在的抑制物因子對其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響進(jìn)行了探討。研究表明,乳酸乳球工程菌L.casei 12AE1具有更好的木質(zhì)纖維素抑制物耐受性;木質(zhì)毒素作為木質(zhì)纖維素水解液中的主要抑制因子對乳酸菌的生長產(chǎn)生了很大的影響,而高濃度葡萄糖的加入對乳酸菌的生長影響不大。通過HPLC分析發(fā)酵產(chǎn)物發(fā)現(xiàn),L.casei 12AE1不僅能更好地生長,其乙醇產(chǎn)量也是最高。乳酸代謝路徑在菌體發(fā)酵過程中依然發(fā)揮作用,而碳源的利用率在抑制物存在的水解液中有待提高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S816.7

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本文編號：2476562