發(fā)布時(shí)間：2019-05-13 22:04

【摘要】：DHX15是近幾年發(fā)現(xiàn)的胞漿RNA識(shí)別受體,屬于DEXD/H-解旋酶家族,能夠通過C端的解旋酶結(jié)構(gòu)域與polyI:C或病毒的dsRNA結(jié)合,然后通過N端的DEXDc結(jié)構(gòu)域與VISA相互作用,激活I(lǐng)RF3、NF-κB和MAPK,誘導(dǎo)IFN-β、IL-6和TNF-a的分泌。迄今為止,僅人和小鼠的DHX15被鑒定,豬DHX15(porcineDHX15,pDHX15)的研究尚未報(bào)道。因此,本研究首先克隆pDHX15基因,然后對(duì)其遺傳進(jìn)化關(guān)系和分子結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析,繼而對(duì)其在誘導(dǎo)I型干擾素中的作用進(jìn)行了初步研究。本研究主要內(nèi)容如下:1.pDHX15基因的克隆與序列分析應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)中克隆了pDHX15基因,然后將其插入pJET1.2/blunt克隆載體中,構(gòu)建了pJET1.2-pDHX15。序列分析發(fā)現(xiàn),pDHX15基因開放閱讀框架(ORF)全長(zhǎng)2388bp,編碼795個(gè)氨基酸,與人類、小鼠、大鼠、牛、羊、犬、貓、馬等哺乳動(dòng)物的同源性都在99.4%以上,而與兩棲類非洲爪蟾、中華鱉、鳥類綠頭鴨、魚類斑馬魚的同源性相對(duì)較低,分別為92.2%、95.3%、94.2%和91.3%;結(jié)構(gòu)分析顯示,pDHX15含有N端的兩個(gè)松散結(jié)構(gòu)域、DEAH-box保守結(jié)構(gòu)域、HELICc解旋酶活性結(jié)構(gòu)域、HA2結(jié)構(gòu)域以及DUF結(jié)構(gòu)域。2.pDHX15的組織差異表達(dá)與亞細(xì)胞定位分析應(yīng)用半定量RT-PCR和Real-timePCR技術(shù)分析pDHX15的mRNA在不同組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,pDHX15mRNA廣泛表達(dá)于所有檢測(cè)的組織中,包括外周血、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、淋巴結(jié)和皮膚,其中在肺臟、淋巴結(jié)和小腸中表達(dá)量最高,心臟、脾臟、腎臟和皮膚次之,外周血和肝臟的表達(dá)量最少。此外,為了研究pDHX15的亞細(xì)胞定位,將構(gòu)建的與EGFP標(biāo)簽融合表達(dá)的pDHX15真核表達(dá)載體pEGFP-pDHX15分別與靶向定位于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體的紅色熒光質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,24h后用激光共聚焦顯微鏡確定pDHX15的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染pEGFP-pDHX15的HEK293T細(xì)胞內(nèi),帶有綠色熒光的pDHX15彌散性的分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi),能夠分別與細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基體靶向定位的紅色熒光重疊。3.pDHX15在誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生中的作用為了研究pDHX15在誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生中的作用,將構(gòu)建的真核表達(dá)載體pCAGGS-HA-pDHX15、pCAGGS-pDHX15-△DUF、pCAGGS-pDHX15-△DUF-△HA2以及pCAGGS-pDHX15-DEXDc分別與豬源IFN-β啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件IRF3和NF-κB熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。結(jié)果顯示,在poly(I:C)刺激下,pCAGGS-HA-pDHX15以劑量依賴的方式顯著活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3、NF-κB以及IFN-β的產(chǎn)生;當(dāng)用siRNA敲降pDHX15后,能夠顯著降低poly(I:C)誘導(dǎo)IRF3和NF-κB以及IFN-β的活化。此外,pDHX15結(jié)構(gòu)域缺失突變顯示,DUF結(jié)構(gòu)域和HELIC酶活性結(jié)構(gòu)域?qū)儆谪?fù)向調(diào)控結(jié)構(gòu)域,能夠負(fù)調(diào)節(jié)poly(I:C)誘導(dǎo)IRF3和NF-κB以及IFN-β的激活。但是,HA2結(jié)構(gòu)域和DEXD結(jié)構(gòu)域是正向調(diào)控結(jié)構(gòu)域,能夠正調(diào)節(jié)poly(I:C)誘導(dǎo)IRF3、NF-κB以及IFN-β的產(chǎn)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),pDHX15以劑量依賴的方式通過招募關(guān)鍵接頭分子VISA和MITA激活I(lǐng)RF3和NF-κB,進(jìn)而誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)。綜上,pDHX15是豬的一個(gè)天然免疫RNA識(shí)別受體,在誘導(dǎo)I型IFNs的產(chǎn)生中具有重要作用。
[Abstract]:DHX15 is a cytoplasmic RNA recognition receptor found in recent years, and belongs to the family of DEXD/ H-helicase. The DHX15 can be combined with the dsRNA of polyI: C or the virus through the helicase domain at the C end, then interacts with the VISA through the DEXDc domain of the N end, activates the IRF3, NF-EMAB and MAPK, and induces the IFN-1, The secretion of IL-6 and TNF-a. To date, only human and mouse DHX15 has been identified, and the study of porcine DHX15 (pDHX15, pDHX15) has not been reported. Therefore, the pDHX15 gene was cloned first, then the genetic evolution and molecular structure of the pDHX15 gene were analyzed, and then the role of the pDHX15 gene in the induction of type I interferon was studied. The main contents of this study are as follows:1. Cloning and sequence analysis of 1. pDHX15 gene. The pDHX15 gene was cloned from peripheral blood lymphocytes (PBMCs) by RT-PCR, and then inserted into pJET1.2/ blunted cloning vector to construct pJET1.2-pDHX15. The sequence analysis showed that the full length of the open reading frame (ORF) of the pDHX15 gene was 2388 bp, encoding 795 amino acids, and the homology with the mammals such as human, mouse, rat, cattle, sheep, dog, cat, horse and other mammals was over 99.4%, and compared with the amphibian African claw, the Chinese soft-shelled turtle and the bird's green-headed duck. The homology of the fish zebrafish is relatively low, 92.2%, 95.3%, 94.2% and 91.3%, respectively; the structural analysis shows that the pDHX15 contains two loose domains at the N end, the DEAH-box conserved domain and the HELICc helicase active domain, The expression of pDHX15 mRNA in different tissues was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and Real-time PCR. The results show that the pDHX15mRNA is widely expressed in all the detected tissues, including peripheral blood, heart, liver, spleen, lung, kidney, small intestine, lymph node and skin, wherein the expression of pDHX15mRNA is the highest in the lung, lymph node and small intestine, and the heart, spleen, kidney and skin are the second. The expression of peripheral blood and liver is the least. In addition, in order to study the subcellular localization of pDHX15, the pDHX15 eukaryotic expression vector pEGFP-pDHX15, which is constructed by fusion expression with the EGFP label, is respectively and targeted to be located in the nucleus and the endoplasmic reticulum, HEK293T cells were co-transfected with the red fluorescent plasmids of the Golgi and the mitochondria, and the subcellular localization of pDHX15 was determined by a laser confocal microscope at 24 h. The results show that, in the HEK293T cells transfected with pEGFP-pDHX15, the pDHX15 with green fluorescence is distributed in the whole cell, and can be respectively connected with the nucleus, the endoplasmic reticulum and the mitochondria. the role of pDHX15 in inducing the production of type I interferon is to study the role of pDHX15 in inducing the production of type I interferon, and the constructed eukaryotic expression vector pCAGGS-HA-pDHX15, pCAGGS-pDHX15-pDHDUF, The pCAGGS-pDHX15-DDUF-pDHA2 and pCAGGS-pDHX15-DEXDc were co-transfected with the porcine source IFN-yeast promoter and the transcription regulatory element IRF3 and the NF-VIB luciferase reporter plasmid, respectively, to HEK293T cells. The results showed that, under the stimulation of poly (I: C), pCAGGS-HA-pDHX15 significantly activated transcription factors IRF3, NF-B and IFN-B in a dose-dependent manner; after pDHX15 was knocked down with siRNA, the activation of poly (I: C)-induced IRF3 and NF-EMAB and IFN-1 was significantly reduced. In addition, that deletion mutation of the pDHX15 domain show that the DUF domain and the HELIC enzyme activity domain belong to the negative regulatory domain, and the activation of the poly (I: C)-induced IRF3 and NF-EMAB and the IFN-antigen can be negatively regulated. However, the HA2 domain and the DEXD domain are forward regulatory domains that are capable of modulating poly (I: C) to induce the production of IRF3, NF-B, and IFN-C. Further studies have found that pDHX15 induces the expression of IFN-antigen in a dose-dependent manner by the recruitment of key linker molecules VISA and MITA to activate IRF3 and NF-B. In general, pDHX15 is a natural immune RNA recognition receptor for pigs and plays an important role in inducing the production of type I IFNs.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S828;Q78

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