【摘要】：豬多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocidain,Pm)感染可引起豬(Sus scrofa)產(chǎn)生豬肺疫、豬出血性敗血癥和豬萎縮性鼻炎等。目前應用的滅活全菌苗交叉保護效果差且免疫保護期短,重組疫苗尚不能提供高的保護率。為研究豬多殺性巴氏桿菌重組甲硫氨酸轉運體Q(recombinant methionine transporter Q,rMetQ)的免疫保護性,本研究根據(jù)GenBank中登錄的Pm metQ基因序列,根據(jù)去除影響表達的長片段疏水區(qū)的相應核苷酸序列設計引物對,以Pm的基因組為模板PCR擴增metQ基因,測序進行生物信息學分析。結果表明,豬Pm metQ基因片段含768 bp核苷酸,編碼255個氨基酸的蛋白質(zhì),其理論分子量為28.14 kD,是與細菌的毒性有關的胞外結合蛋白,不同血清型的該蛋白同源型達99%以上。將Pm metQ亞克隆到pET-28a(+)構建重組質(zhì)粒pET-metQ并轉化至大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3),用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導表達Pm rMetQ,經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測,結果表明,在28 kD處出現(xiàn)特異性條帶。動物保護實驗采用昆明小鼠(Mus musculus)進行,免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)抗體滴度采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)檢測。結果表明,3次免疫后第14天,鋁佐劑+rMetQ組小鼠血清中的IgG抗體水平顯著升高,明顯高于對照組和低劑量組,對照組和低劑量組小鼠攻毒后3 d存活率為20%,7 d后全部死亡。鋁佐劑+30μg rMetQ免疫組,10只免疫組小鼠3 d后,6只死亡,存活率為40%;7 d后,又有3只死亡,存活率為10%。鋁佐劑+50μg rMetQ組3 d后存活率達80%,7 d后存活率40%。死亡小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟為主要病變器官,呈現(xiàn)有不同程度的出血點甚至壞死�？梢�,Pm rMetQ皮下免疫注射可誘導小鼠產(chǎn)生免疫應答和較高的抗攻擊感染的免疫保護力。該研究為進一步篩選豬Pm分子疫苗積累了資料。
[Abstract]:Porcine (Sus scrofa) infection with pasteurella multocida (Pasteurella multocidain,Pm) can cause swine pulmonary disease, hemorrhagic septicemia and atrophic rhinitis in pigs. At present, the cross-protection effect of inactivated whole bacteria vaccine is poor and the immune protection period is short, so the recombinant vaccine can not provide a high protection rate. In order to study the immune protection of recombinant methionine transporter (Q (recombinant methionine transporter Q, rMetQ) of Pasteurella multocida in pigs, this study was based on the sequence of Pm metQ gene logged in GenBank. Primer pairs were designed according to the corresponding nucleotide sequences to remove the long hydrophobic region of the expression. The metQ gene was amplified by PCR using the genome of Pm as the template, and the bioinformatics analysis was carried out by sequencing. The results showed that the porcine Pm metQ gene contains 768 bp nucleotides and encodes a 255amino acid protein. Its theoretical molecular weight is 28.14 kD, which is an extracellular binding protein related to the toxicity of bacteria. The homologue of the protein in different serotypes was more than 99%. Pm metQ was subcloned into pET-28a () to construct recombinant plasmid pET-metQ and transformed into E. coli (Escherichia coli) BL21 (DE3). Pm rMetQ, was induced to express Pm rMetQ, by isopropyl 尾-D-thiogalactoside (isopropyl 尾-D-thiogalactoside). Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) showed that there was a specific band at 28 kD. The antibody titers of immunoglobulin G (immunoglobulin-G) were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA). The animal protection test was carried out with Kunming mouse (Mus musculus). The results showed that on the 14th day after 3 times of immunization, the level of serum IgG antibody in the aluminum adjuvant rMetQ group was significantly higher than that in the control group and the low dose group, and the survival rate of the control group and the low dose group was 20% on the 3rd day after challenge, and the survival rate of the control group and the low dose group was 20%. All died 7 days later. In the aluminum adjuvant 30 渭 g rMetQ-immunized group, 6 mice died after 3 days of immunization, the survival rate was 40% and 7 days later, and the survival rate was 10%. The survival rate of 50 渭 g rMetQ group was 80% after 3 d and 40% after 7 d. The liver of the dead mice was found to be the main pathological organ, showing different degrees of bleeding and necrosis. It can be seen that subcutaneous injection of, Pm rMetQ can induce immune response and high immune protection against aggressive infection in mice. This study provided data for further screening of porcine Pm molecular vaccines.
【作者單位】： 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院;湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院;
【基金】：湖南省自然科學基金項目(No.14JJ4077)
【分類號】：S852.61

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本文編號：2465095