【摘要】：卵丘細(xì)胞是一種高度特異性的細(xì)胞,圍繞在有腔卵泡卵母細(xì)胞以及早期胚胎的周圍。卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系對卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟有著重要的作用。研究顯示卵丘擴展是卵母細(xì)胞成熟的首要形態(tài)學(xué)指標(biāo)并且高劑量的雌激素可明顯促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴展。雌激素核受體的兩種亞型ERα和ERβ廣泛分布在多種組織和細(xì)胞中,介導(dǎo)了雌激素的大部分作用,但是雌激素也可以快速調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的事件,如cAMP的產(chǎn)生,Ca2+的遷移等,這些快速的雌激素效應(yīng)并不涉及某些細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活化,而是直接作用于細(xì)胞的表面。Filardo等發(fā)現(xiàn)了一種雌激素的膜受體G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30,GPR30),研究顯示GPR30可以在某些條件下快速介導(dǎo)上述雌激素事件。雖然GPR30在許多細(xì)胞和組織中扮演著重要的作用,但是在山羊卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞中是否也存在GPR30的表達(dá),目前還沒有被報道出來。因而本研究首先檢測了體外培養(yǎng)山羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes,COCs)24 h前后,GPR30的表達(dá)和定位。在確定GPR30存在于山羊COCs中的基礎(chǔ)上使用G1和G15進(jìn)一步研究了GPR30在山羊卵母細(xì)胞成熟過程中對卵丘擴展的影響,并研究了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號通路在山羊成熟培養(yǎng)過程中對卵丘擴展的作用機制。其研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)利用免疫熒光的方法,檢測了體外成熟培養(yǎng)24 h前后的山羊COCs中GPR30的定位與表達(dá),結(jié)果顯示,在山羊卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞上都存在GPR30的表達(dá),并且定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。另外,qRT-PCR和Western Blotting的結(jié)果顯示,體外成熟培養(yǎng)山羊COCs 24 h前后,都有GPR30 mRNA和蛋白的表達(dá),并且在體外培養(yǎng)24 h后,COCs與卵丘細(xì)胞中GPR30 mRNA和蛋白表達(dá)水平都明顯較培養(yǎng)前高(P0.05),成熟卵母細(xì)胞中GPR30 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著比成熟培養(yǎng)前低(P0.05)。(2)在上述研究的基礎(chǔ)上,首先利用雌激素的特異性激動劑G1和特異性抑制劑G15研究了是否GPR30介導(dǎo)了雌激素對卵母細(xì)胞成熟的影響。體外成熟培養(yǎng)24 h后的山羊COCs,依照卵母細(xì)胞中第一極體的排出情況,統(tǒng)計17β-E_2組、對照組、G1組和17β-E_2與G15共同處理組中卵母細(xì)胞的成熟率。結(jié)果顯示,17β-E_2組較對照組顯著促進(jìn)了山羊卵母細(xì)胞的成熟(P0.05),G1組也明顯較對照組中的成熟卵母細(xì)胞數(shù)量多(P0.05),雖然G1組的成熟率低于17β-E_2組的成熟率,但是兩組之間并沒有顯著的差別(P0.05),表明G1可以在一定程度上模仿17β-E_2對卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)效應(yīng)。而G15與17β-E_2共同處理COCs 24 h后,卵母細(xì)胞的成熟率明顯較17β-E_2組和G1組低(P0.05),但是較對照組卻顯著增加了成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量(P0.05),表明山羊卵母細(xì)胞的成熟受到了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號通路的調(diào)控,至少部分由GPR30介導(dǎo)。(3)為了研究雌激素的膜受體GPR30介導(dǎo)的雌激素信號通路在山羊卵母細(xì)胞成熟過程中對卵丘擴展的影響,將體外培養(yǎng)24 h后的山羊COCs,根據(jù)Vanderhyden等(1990)文獻(xiàn)中報道的卵丘擴展分級和擴展指數(shù)的評估方法,分別統(tǒng)計不同處理組和對照組中的卵丘細(xì)胞的擴展指數(shù)。結(jié)果顯示,與對照組相比,17β-E_2單獨處理能夠明顯增加山羊卵丘細(xì)胞的擴展指數(shù)(P0.05),并且G1也能夠增加山羊卵丘細(xì)胞擴展指數(shù),另外17β-E_2與G15聯(lián)合處理COCs 24 h后,卵丘細(xì)胞的擴展指數(shù)比對照組高,但是兩組之間沒有明顯的差異(P0.05),而與17β-E_2組和G1組相比,卻降低了卵丘細(xì)胞的擴展指數(shù)。另外在體外培養(yǎng)山羊COCs 24 h后,研究了上述各組中與卵丘擴展有關(guān)基因(HAS2,PTGS2,PTX3,TNFAIP6)的相對表達(dá)水平,qRT-PCR的結(jié)果顯示,17β-E_2組和G1組較對照組明顯增加了卵丘細(xì)胞中HAS2和PTX3 mRNA的表達(dá)水平(P0.05),但是PTGS2和TNFAIP6 mRNA的表達(dá)水平在17β-E_2組、G1組和17β-E_2和G15共同處理組中沒有明顯的差異(P0.05)。(4)為了進(jìn)一步探討GPR30介導(dǎo)的雌激素信號通路對山羊卵母細(xì)胞成熟過程中卵丘擴展的作用機制,采用ELISA的方法測定山羊COCs中的cAMP水平,結(jié)果顯示,17β-E_2組能夠明顯較對照組增加山羊COCs中cAMP水平,G1組也能夠較對照組明顯增加cAMP的水平(P0.05),進(jìn)一步表明雌激素與GPR30結(jié)合促進(jìn)了COCs中cAMP的產(chǎn)生。然而17β-E_2組與G1組相比,有著明顯的差異,G15處理山羊COCs 2 h后也明顯較對照組中的cAMP水平高,但與17β-E_2組和G1組相比較卻明顯低于上述兩組山羊COCs中的cAMP水平(P0.05)。另外根據(jù)之前的研究顯示ERK1/2可以促進(jìn)卵丘細(xì)胞的擴展,推測雌激素可能通過影響ERK1/2的磷酸化水平促進(jìn)卵丘的擴展。因此將山羊COCs分別在對照組(未添加17β-E_2)、G1(100 nM)組、17β-E_2(1μg/mL)+G15(100 nM)組和17β-E_2(1μg/mL)組中培養(yǎng)30 min,探究了GPR30介導(dǎo)的雌激素信號通路對山羊COCs中ERK1/2的磷酸化水平的影響,蛋白質(zhì)免疫印跡的檢測結(jié)果顯示,17β-E_2和G1分別單獨處理COCs 30 min時明顯較對照組中的ERK1/2的磷酸化水平高,但G1組ERK1/2的磷酸化水平與17β-E_2組ERK1/2的磷酸化水平相比卻有顯著的差異(P0.05)。然而G15的添加卻明顯降低了17β-E_2對ERK1/2磷酸化水平的促進(jìn)作用,而且G15與17β-E_2共同處理組中的ERK1/2磷酸化水平依然顯著比對照組高(P0.05),表明GPR30介導(dǎo)的17β-E_2通過調(diào)控ERK1/2的磷酸化水平促進(jìn)了山羊卵丘細(xì)胞的擴展。綜上所述,在體外培養(yǎng)24 h前后的山羊COCs中,卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞上都存在GPR30的表達(dá),且定位在細(xì)胞的質(zhì)膜上。GPR30介導(dǎo)了17β-E_2(1μg/mL)對山羊卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)作用。17β-E_2(1μg/mL)通過GPR30增加山羊COCs中cAMP水平及ERK1/2的磷酸化水平,最終促進(jìn)了山羊卵丘細(xì)胞的擴展。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S827

【參考文獻(xiàn)】

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1 呂麗華;李富忠;岳文斌;;成熟液中添加不同濃度雌二醇對山羊卵母細(xì)胞成熟的影響[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年12期

2 岳順利,周佳勃,嚴(yán)云勤;卵丘在卵母細(xì)胞成熟中的作用[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2005年04期

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1 邢華;創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因犬的相關(guān)基礎(chǔ)研究[D];揚州大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 蔡姣;雌激素對C型鈉肽誘導(dǎo)的山羊卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 張駿鴻;C型鈉肽對山羊卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎發(fā)育的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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本文編號：2458144