【摘要】：喹乙醇作為喹VA啉-1,4-二氮氧化物的重要一員,因其具有良好的抗菌活性和促生長(zhǎng)作用,在養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用,但耐藥性也隨之出現(xiàn)。2004年發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒pOLA52上攜帶的耐藥基因oqxAB,它由oqxA基因和oqxB基因組成,屬于耐藥結(jié)節(jié)分化家族(Resistance-nodulation-division family, RND家族),編碼多重耐藥外排泵。oqxAB不僅介導(dǎo)喹VA啉類藥物耐藥,還可降低細(xì)菌對(duì)氯霉素、喹諾酮類藥物的敏感性,因此2009年oqxAB也被歸為質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥(Plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR)基因。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于oqxAB基因的流行病學(xué)及其耐藥機(jī)制研究還較為匱乏。為了解oqxAB在大腸埃希菌(大腸桿菌)中的流行狀況及其耐藥機(jī)制,本研究調(diào)查分析了1993-2014年oqxAB及其它PMQR基因在我國(guó)大腸桿菌中的流行狀況,對(duì)oqxAB+菌株進(jìn)行PFGE分型和基因定位,探究它在我國(guó)流行率較高的原因。通過(guò)測(cè)定776株禽源分離株對(duì)喹嗯啉類藥物(喹乙醇和乙酰甲喹)的最小抑菌濃度,分析基因型與耐藥表型的關(guān)系；對(duì)特殊菌株進(jìn)行基因定位和測(cè)序,試圖解釋出現(xiàn)特殊情況的原因；同時(shí)對(duì)oqxAB+供體菌和接合子進(jìn)行耐藥分析,研究oqxAB基因在細(xì)菌耐藥中所起的作用,初步探索其耐藥機(jī)制。1. oqxAB等質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥基因在大腸桿菌中的流行狀況本研究對(duì)1993-2014年1523株不同源大腸桿菌中PMQR基因進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)PMQR基因具有很高的陽(yáng)性率(33.3%),在所有的PMQR基因中,oqxAB陽(yáng)性率最高,為26.1% (397/1523), aac(6')-Ib-cr和qnrS的陽(yáng)性率次之(7.6%和6.0%),未檢測(cè)到qnrC和qnrD基因,oqxAB的陽(yáng)性率顯著高于其它PMQR基因,尤其是在豬源分離株中陽(yáng)性率可達(dá)51.9%。oqxAB還可聯(lián)合其它基因一同存在,最常見的組合為oqxAB+aac(6')-Ib-cr,三陽(yáng)性菌株中oqxA B+aac (6')-Ib-cr+qnrS也較為常見。豬源和禽源菌株中,oqxAB聯(lián)合其它基因共存在的菌株數(shù)可占o(jì)qxAB陽(yáng)性菌株數(shù)的23.0%和24.5%。本研究探討了oqxAB高陽(yáng)性率原因。選取70株oqxAB+菌株進(jìn)行PFGE分型,結(jié)果顯示除個(gè)別菌株外,大部分菌株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),耐藥基因主要通過(guò)水平傳播,人源菌株可通過(guò)不同的機(jī)會(huì)獲得耐藥基因。另對(duì)43株oqxAB+菌株進(jìn)行S1-PFGE和Southern雜交, oqxAB多定位于易轉(zhuǎn)移的大質(zhì)粒上。耐藥基因通過(guò)質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的方式進(jìn)行散播,可能成為oqxAB流行率高的重要原因。同時(shí),oqxAB還可和其它PMQR基因一起位于同一質(zhì)粒上,這種現(xiàn)象更促進(jìn)了耐藥基因的擴(kuò)散,并可能會(huì)導(dǎo)致更容易篩選出高水平的耐藥菌株,對(duì)人類健康造成威脅。分析1993-2014年間禽源菌株oqxAB陽(yáng)性率、喹乙醇和乙酰甲喹耐藥率的變化,二者均呈上升趨勢(shì),且1993-2004年這十年耐藥率與oqxAB陽(yáng)性率都無(wú)太大變化且維持比較低的水平。2005年農(nóng)業(yè)部開始批準(zhǔn)使用喹乙醇,2006年開始批準(zhǔn)使用乙酰甲喹,于是從2005-2008年這階段oqxAB陽(yáng)性率和菌株耐藥率開始迅速增長(zhǎng),到2014年都已達(dá)到或接近50%。雖然喹乙醇和乙酰甲喹的批準(zhǔn)數(shù)量有下降趨勢(shì),但藥物的累積作用對(duì)oqxAB基因流行所產(chǎn)生的影響不容小覷。2. oqxAB的耐藥機(jī)制研究測(cè)定776株禽源大腸桿菌對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹的MIC值,當(dāng)喹乙醇和乙酰甲喹的MIC ≥256 μg/mL時(shí),菌株全為oqxAB+菌株：當(dāng)兩種藥物的MIC為128 μg/mL時(shí),oqxAB+菌株所占比率分別為83.9%和96.3%；分離株對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹MIC為64 μg/mL時(shí),oqxAB+菌株的比例(78.2%和69.6%)顯著高于oqxAB菌株(21.8%和23.2%),而當(dāng)MIC為32 μg/mL時(shí),oqxAB菌株的比例(93.0%和67.1%)顯著高于oqxAB+菌株(7.0%和32.9%)。因此設(shè)定64 μg/mL為耐藥臨界點(diǎn),MIC為32 μg/mL時(shí)為中介,μg/mL時(shí)為敏感�？傮w來(lái)說(shuō)oqxAB+菌株對(duì)喹乙醇耐藥或者中介的比例為98.6%,對(duì)乙酰甲喹耐藥或者中介的比例為95.0%。oqxAB菌株對(duì)喹乙醇敏感或者中介的比例為91.9%,對(duì)乙酰甲喹敏感或者中介的比例為95.5%,陽(yáng)性菌株的MIC50和MIC90顯著高于陰性菌株,耐藥表型和基因型基本一致。但分別有45株和25株oqxAB菌株對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹表現(xiàn)耐藥,3株和11株oqxAB+菌株對(duì)兩種藥物表現(xiàn)敏感。本研究對(duì)3株含有oqxAB但對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹的MIC較低的菌株進(jìn)行深入研究。通過(guò)S1-PFGE和Southern blot對(duì)oqxAB進(jìn)行定位,其位于菌株的染色體上。又對(duì)oqxAB基因及其兩翼序列進(jìn)行測(cè)序,oqxAB基因序列與質(zhì)粒pOLA52和克雷伯菌染色體序列同源性為96%-99%,oqxAB的側(cè)翼序列與克雷伯菌基因組序列高度相似,在oqxA側(cè)都有AraC轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族。AraC轉(zhuǎn)錄調(diào)控家族可調(diào)節(jié)oqxAB的表達(dá),這些菌株可能受到AraC的調(diào)節(jié),使菌株雖然含有oqxAB基因但因其表達(dá)量下降而對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹敏感。對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的接合子及其供體菌測(cè)定其對(duì)各類藥物的MIC值,并測(cè)定供體菌QRDR突變。oqxAB可使受體菌獲得對(duì)喹乙醇和乙酰甲喹的耐藥性,并可使MIC達(dá)到供體菌的水平,而其它PMQR基因?qū)@兩種藥物沒有影響。對(duì)于喹諾酮類典型藥物環(huán)丙沙星來(lái)說(shuō),oqxAB僅僅介導(dǎo)低水平的耐藥,它可使接合子的MIC升高2-16倍,但與耐藥臨界點(diǎn)還相差很遠(yuǎn)。除了喹嗯啉類藥物和喹諾酮類藥物,oqxAB的轉(zhuǎn)移還可使氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素和慶大霉素的耐藥性發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

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