【摘要】：為鑒定并表達豬帶絳蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑(TsSerpin),提取豬囊尾蚴總RNA,設計引物并通過RT-PCR技術(shù)擴增TsSerpin4848基因,將純化的PCR產(chǎn)物連接到p MD19-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆并測序,并用生物信息學方法分析其序列和結(jié)構(gòu)特征。構(gòu)建p ET-30a(+)-4848重組表達載體,經(jīng)酶切鑒定及測序驗證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達,目的蛋白純化后進行SDSPAGE和Western-blot分析。結(jié)果表明,TsSerpin4848的開放閱讀框由1 065個核苷酸組成,編碼355個氨基酸殘基,其理論分子質(zhì)量約為39 ku。TsSerpin4848含有serpin家族保守序列DEEGAE和FIVDHPFLFFI,并含有serpin特有的反應中心環(huán)結(jié)構(gòu)域,其三級結(jié)構(gòu)中有8個ɑ螺旋和3個β折疊;重組TsSerpin4848蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體形式存在,可被豬囊尾蚴陽性血清識別,表明TsSerpin4848蛋白具有良好的反應原性,有望作為豬囊蟲病診斷的候選抗原。
[Abstract]:In order to identify and express serine protease inhibitor (TsSerpin), of Taenia solium, primers were designed to extract total RNA, from cysticercus cellulosae and TsSerpin4848 gene was amplified by RT-PCR. The purified PCR products were ligated into p-MD19-T vector and transformed into E. coli DH5 competent cells. The positive clones were screened and sequenced, and their sequence and structural characteristics were analyzed by bioinformatics method. The recombinant expression vector p ET-30a ()-4848 was constructed, identified by restriction endonuclease digestion and sequencing, and then transformed into E. coli BL21 (DE3) for induced expression. The target protein was purified and analyzed by SDSPAGE and Western-blot. The results show that the open reading frame of TsSerpin4848 consists of 1 065 nucleotides and encodes 355amino acid residues. Its theoretical molecular weight is about 39 ku.TsSerpin4848 containing the conserved sequences DEEGAE and FIVDHPFLFFI, of serpin family and the specific reaction center domain of serpin. There are 8 helices and 3 尾 folds in the tertiary structure. The recombinant TsSerpin4848 protein was mainly in the form of inclusion body in E. coli and could be recognized by the positive serum of cysticercus cellulosae. It indicated that the TsSerpin4848 protein had good reactivity and could be used as a candidate antigen for the diagnosis of cysticercosis.
【作者單位】： 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室;
【基金】：國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0501303) 國家自然科學基金面上項目(31372433)
【分類號】：S852.734

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