【摘要】：豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是豬的一種急性腸道傳染病,該病病原為豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。從2010年下半年起,豬流行性腹瀉在我國南方十多個(gè)省份傳播開來,且表現(xiàn)出發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)。近幾年,我國不同地區(qū)流行的PEDV毒株之間的親緣關(guān)系有一定的差異性,很多地區(qū)的流行毒株與傳統(tǒng)疫苗株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn),這給豬流行性腹瀉的防控帶來很大的困難。由于豬流行性腹瀉與豬的一些其它腹瀉性疾病,尤其是豬傳染性胃腸炎,在臨床癥狀和病理變化上都非常相似,根據(jù)臨床癥狀和病理變化無法進(jìn)行確診,因此,急需建立一種快速、準(zhǔn)確且易于在基層推廣的診斷方法。本研究對(duì)2014年上海地區(qū)流行的9株P(guān)EDV毒株進(jìn)行基因變異分析,為掌握上海地區(qū)PEDV的流行特點(diǎn)和上海地區(qū)PED的防控提供科學(xué)的依據(jù)。此外,還對(duì)PEDV的N蛋白進(jìn)行原核表達(dá),用表達(dá)的N蛋白作為抗原,建立了 PEDV間接ELISA診斷方法,為豬流行性腹瀉ELISA試劑盒的開發(fā)提供了良好的理論基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下:1.2014年上海地區(qū)豬流行性腹瀉病毒基因變異分析利用RT-PCR對(duì)2014年上海地區(qū)流行的9株P(guān)EDV毒株的S、M、ORF3基因進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與PEDV的參考序列用軟件進(jìn)行比對(duì)分析,并繪制出基因進(jìn)化樹。與CV777參考毒株相比,本研究中的9個(gè)毒株S蛋白的氨基酸序列均存在2處氨基酸的插入和1處氨基酸的缺失;在S蛋白的抗原表位區(qū)域COE和線性表位S1D6的核心序列SS6處,某些氨基酸發(fā)生了點(diǎn)突變;而在線性表位S1D5的核心序列SS2和線性表位2C10處完全保守;M蛋白的氨基酸序列有4處氨基酸發(fā)生了點(diǎn)突變;ORF3蛋白的氨基酸序列有7處氨基酸發(fā)生了點(diǎn)突變。S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示本研究中的9個(gè)毒株與2013年美國的流行毒株和韓國2008～2009年的流行毒株的親緣關(guān)系較近,而與我國目前主要的疫苗株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。M基因系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示本研究中的9個(gè)毒株與2013年美國的流行毒株、2007～2008年的泰國流行毒株和2007年的韓國流行毒株關(guān)系最近,而與我國目前主要的疫苗株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。ORF3基因的進(jìn)化樹表明本研究中的9個(gè)PEDV毒株與2007年韓國流行毒株和2013年美國的流行毒株親緣關(guān)系較近,而與我國目前主要的疫苗株CV777親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。2.PEDVN蛋白的原核表達(dá)利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)出一對(duì)擴(kuò)增PEDV N基因全長的引物,對(duì)2014年上海地區(qū)PEDV流行株的N基因進(jìn)行擴(kuò)增,并將其克隆到pET30a載體上,構(gòu)建出重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-N。將pET30a-N轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),證實(shí)重組目的蛋白得到了有效表達(dá),且表達(dá)的重組目的蛋白主要存在于包涵體中。將包涵體溶解、純化、復(fù)性后進(jìn)行Western-blot鑒定,鑒定結(jié)果表明目的蛋白與PEDV抗體反應(yīng)性良好。3.PEDV間接ELISA診斷方法的建立用純化好的重組N蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行ELISA,通過一系列條件優(yōu)化試驗(yàn)確定出各個(gè)反應(yīng)條件,建立出PEDV間接ELISA診斷方法。用建立好的ELISA方法和BIOVET公司生產(chǎn)的豬流行性腹瀉病毒抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)對(duì)92份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè),符合率達(dá)89.1%,符合率較高,說明此方法可用于血清樣品的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。最后,用所建立的ELISA診斷方法對(duì)2014年11月份采集自上海地區(qū)15個(gè)規(guī)�；i場(chǎng)的423份臨床血清進(jìn)行檢測(cè),PEDV抗體陽性率為41.8%。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2428450