【摘要】：豬丹毒(swine erysipelas),也叫"鉆石皮膚病"(diamond skin disease)或"紅熱病"(red fever),是由紅斑丹毒絲菌引起的一種急性、熱性傳染病。多年以前,豬丹毒和豬瘟、豬肺疫并稱豬三大傳染病,給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)中抗生素和疫苗的大量使用,豬丹毒的發(fā)病得到了有效控制并一度銷聲匿跡。因此,目前豬丹毒在豬的傳染病防控中受重視程度不高,對豬丹毒的致病特性、毒力變化、流行狀況知之甚少。然而2013年7月以來,本實驗室從不同豬場的送檢病料中分離到了 7株疑似豬丹毒桿菌,經(jīng)PCR鑒定,均確定為豬丹毒桿菌。同時,全國多地也陸續(xù)有關于豬場流行豬丹毒的報道,說明我國豬丹毒的發(fā)病率呈上升趨勢。為了監(jiān)控目前我國豬丹毒桿菌在豬群中的狀態(tài),探查其是否發(fā)生了毒力、耐藥性等方面的變異,本研究通過血清型鑒定、spaA高變區(qū)序列分析、脈沖場凝膠電泳、吖啶橙敏感性試驗、小鼠致病試驗和藥敏試驗,對分離的豬丹毒桿菌進行了一次系統(tǒng)的鑒定。同時為了研究豬丹毒桿菌的致病機制,將其中一株分離株HX130709置于含吖啶橙的培養(yǎng)基上連續(xù)傳55代,得到了致弱株HX130709a。利用上述強、弱毒株進行了小鼠感染豬丹毒桿菌后的細胞因子檢測、3D4/21細胞體外吞噬試驗和不同方式菌苗的免疫特性研究,以期對豬丹毒桿菌的致病機制研究和疫苗研發(fā)提供新的思路。具體研究內(nèi)容分為以下4個部分:1.豬丹毒桿菌的分離和鑒定2013年7月至2013年11月,本實驗室陸續(xù)收到來自湖北南漳、安徽和縣、宣城、江蘇泗洪、鹽城等地送來的病料7份,送檢臟器(心、肝、脾、肺)均呈典型敗血癥變化,脾臟損傷最為嚴重,充血、腫脹十分明顯。主訴病豬突然死亡,有些死亡豬只從不吃食到死亡僅1d時間。為確定病原,按常規(guī)無菌操作分離并純化細菌,根據(jù)其形態(tài)特征和PCR鑒定結果,結合臨床癥狀,確診為豬丹毒桿菌感染。該菌在TSA平板、BHI平板和鮮血平板上均生長良好。顯微鏡觀察可見革蘭氏陽性短桿菌,亦有少量絲狀長桿菌出現(xiàn)。為了分析各地流行豬丹毒的原因,探究這幾株豬丹毒桿菌之間的關系,我們對上述7個臨床分離株、本實驗室2009年分離保存的一個豬丹毒臨床分離株以及市場上流通的弱毒疫苗株G4T10共9個菌株進行了系統(tǒng)的鑒定,結果顯示這9個菌株都為血清1型,其中4株對吖啶橙敏感,所有臨床分離株都對小鼠有很高的致死性。與疫苗株的spaA序列相比,8個分離株可以分為4個spa4型。脈沖場凝膠電泳(PFGE)結果未見完全相同的脈沖場帶型。藥敏試驗結果表明,該類菌對β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素敏感,對卡那霉素和磺胺異惡唑耐受。2.豬丹毒桿菌分離株的致弱及其致弱株的特性鑒定選取8個臨床分離株中對吖啶橙最敏感的HX130709株進行致弱,以期得到毒力減弱或喪失的豬丹毒桿菌致弱株。將HX130709株接種到AO-BHI平板上,連續(xù)傳代的同時增加吖啶橙的濃度,每隔5代凍存細菌,并對保存的各代次細菌進行系統(tǒng)鑒定,結果發(fā)現(xiàn):隨著在AO-BHI平板上的傳代,該菌對吖啶橙的耐受能力從0.0025%上升至0.03%;小鼠致病試驗證明該菌的毒力在F46-F50之間發(fā)生了致弱,將致弱株命名為HX130709a;擴增保存的各代次細菌的spaA序列,在432bp的高變區(qū)未發(fā)現(xiàn)任何突變;脈沖場凝膠電泳結果顯示從F15開始,各代次細菌的PFGE帶型基本一致;藥敏試驗結果顯示:相較于HX130709株,HX130709a株對大部分抗生素的敏感性有了大幅增強,尤其是對鏈霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和林可霉素的敏感性從耐受直接變?yōu)槊舾?但是致弱株對恩諾沙星、環(huán)丙沙星依然表現(xiàn)中度敏感,對卡那霉素、磺胺異惡唑完全耐受。本次實驗獲得了豬丹毒桿菌致弱株HX130709a,為篩選豬丹毒桿菌毒力因子打下了基礎。3.豬丹毒桿菌的致病特性研究為了研究豬丹毒桿菌的致病機制,將豬丹毒強毒株HX130709和弱毒株HX130709a分別感染小鼠,在感染后6h、12h、24h、36h和48h分別處死小鼠,分離脾淋巴細胞,提取淋巴細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后用實時熒光定量PCR方法檢測小鼠脾淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ的表達水平。同時,將強、弱毒株分別感染豬肺泡巨噬細胞系3D4/21細胞,在孵育30min、60min、90min和120min后,洗去多余細菌,固定細胞,封片后用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞吞噬細菌的情況。結果顯示,豬丹毒桿菌弱毒株在感染早期,能刺激小鼠產(chǎn)生高水平的IL-10,而中后期對小鼠IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的刺激不明顯;強毒株在感染早期,可以誘導小鼠產(chǎn)生高水平的IFN-γ,中期能刺激IL-2、IL-4尤其是IL-6的高表達,后期各細胞因子表達量降至低水平。強毒株對3D4/21細胞的抗吞噬能力強于弱毒株。豬丹毒強、弱毒株感染小鼠后誘導細胞因子的水平以及對3D4/21細胞的抗吞噬能力的差異,為豬丹毒桿菌的致病機制研究提供了參考。4.豬丹毒不同形式菌苗的免疫特性研究通過對豬丹毒桿菌臨床分離株分別進行1%甲醛和0.4%吖啶橙滅活、制備高壓菌體浸出物、沉淀細菌后取培養(yǎng)物上清,將上述四種滅活形式的疫苗經(jīng)乳化后,和致弱株一起,分別免疫小鼠并對免疫效果進行比較,以期尋找一種高效、安全的疫苗。各試驗組小鼠分別皮下注射1.5 × 109CFU/只的滅活細菌、等量細菌的高壓浸出物或培養(yǎng)物上清;致弱株的接種劑量為1×107CFU/只,每只注射O.1mL;對照組小鼠皮下每只注射O.1mLPBS。共進行兩次免疫,一免后第14天進行二免,二免后第14天時,按強毒株1×104CFU/只的劑量進行攻毒,每只小鼠注射O.1mL。試驗中,分別在一免后7天、14天、28天、42天進行小鼠尾尖采血,并用間接ELISA方法檢測SpaA抗體水平。結果表明,上清組、AO組、高壓浸出物組、甲醛組雖然能夠誘導小鼠體內(nèi)SpaA抗體的產(chǎn)生,但抗體水平非常低;而弱毒組在一免后的第14天與第28天,抗體始終保持在較高水平。攻毒試驗表明滅活形式的疫苗不能為小鼠提供完全的保護;相比之下,弱毒苗所用劑量小,而且能完全保護小鼠免于豬丹毒桿菌強毒株的致死性感染。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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本文編號：2418743