【摘要】：鴨甲肝病毒(Duck hepatitis A virus,DHAV)是危害雛鴨的一種急性、高致死性傳染病,主要侵害3周齡以內(nèi)雛鴨,嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展。近年來,隨著養(yǎng)鴨業(yè)不斷向產(chǎn)業(yè)化、集約化和規(guī)�；较虬l(fā)展,血清學(xué)上不同于鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)的報(bào)道逐漸增多,鴨甲肝病毒3型(DHAV-3)已在國內(nèi)許多地區(qū)廣泛流行,傳統(tǒng)的鴨肝炎的主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫失敗現(xiàn)象頻繁發(fā)生,對鴨肝炎的防控提出了新的挑戰(zhàn)。VP1基因和VP3基因是鴨甲肝病毒的主要抗原基因。本試驗(yàn)主要將鴨甲肝病毒1型VP3和3型VP1串聯(lián)基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),并以純化的重組蛋白為抗原建立鴨病毒性肝炎抗體檢測的間接ELISA方法。將擴(kuò)增的DHAV-1 VP3和DHAV-3 VP1基因克隆到p ET-32a(+)原核表達(dá)載體中,獲得重組表達(dá)質(zhì)粒p ET-1VP3-3VP1。利用IPT G誘導(dǎo)表達(dá),對目的蛋白進(jìn)行Western blot檢測,確定其免疫反應(yīng)性。然后以純化的重組蛋白為抗原建立了相應(yīng)的抗體ELISA檢測方法,從而為DHAV-1和DHAV-3的快速血清學(xué)診斷奠定了一定的基礎(chǔ)。本研究主要包括以下三部分內(nèi)容:1.p ET-1VP3-3VP1重組表達(dá)載體的構(gòu)建提取鴨甲肝病毒1型(DHAV-1)和3型(DHAV-3)的RNA,利用設(shè)計(jì)的2對特異性引物分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,得到714bp的1VP3基因和720bp的3VP1基因,將純化的1VP3和3VP1基因分別克隆至p MD18-T載體中,構(gòu)建1VP3-3VP1基因克隆重組質(zhì)粒,然后依次將1VP3-3VP1定向插入p ET-32a(+)表達(dá)載體,篩選獲得含1VP3和3VP1基因正向插入的、有正確讀碼框的重組質(zhì)粒p ET-1VP3-3VP1。用Bam H I和Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測出兩條條帶,分別在5900bp和1434bp左右,與預(yù)期大小相符。2.pET-1VP3-3VP1的原核表達(dá)對獲得重組表達(dá)載體pET-1VP3-3VP1菌液,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá),對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DHAV-1VP3-3VP1蛋白在大腸桿菌中可穩(wěn)定、高效地表達(dá)。將表達(dá)的重組蛋白純化后只有一條74.1k Da的蛋白條帶,與未純化前的重組表達(dá)產(chǎn)物條帶的大小一致。Western blot檢測結(jié)果表明,表達(dá)的重組蛋白與DHAV-1和DHAV-3陽性血清均能發(fā)生特異性反應(yīng)。3.檢測DHAV-1和DHAV-3抗體的間接ELISA方法的建立利用純化的DHAV-1VP3-3VP1蛋白作為包被抗原,分別以抗DHAV-1和DHAV-3的二價(jià)陽性血清為一抗,HRP標(biāo)記的羊抗鴨Ig G為二抗建立間接ELISA檢測方法。確定間接ELISA方法的抗原最佳包被濃度為1.0μg/孔,血清最佳稀釋度為1:200,臨界值為OD650值≥0.38,建立的間接ELISA方法具有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。對收集的22份DHAV-1和DHAV-3二價(jià)陽性血清進(jìn)行檢測,并進(jìn)行相關(guān)性分析,相關(guān)系數(shù)0.9,表明建立的計(jì)算血清樣品單一稀釋度ET值的標(biāo)準(zhǔn)直線方程具有較好的參考性。用該方法和中和試驗(yàn)分別檢測DHAV-1和DHAV-3陽性血清,兩種方法的符合率各為96.3%和96.77%,初步臨床應(yīng)用結(jié)果表明本試驗(yàn)以大腸桿菌表達(dá)的DHAV-1VP3-3VP1重組蛋白建立的間接ELISA方法可用于雛鴨母源抗體和免疫后抗體的消長規(guī)律的檢測。
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【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉慶軍,張永光;口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)及其功能[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2005年05期

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本文編號(hào)：2383286