【摘要】：干擾素是人和其他動(dòng)物機(jī)體內(nèi)非常重要的一種細(xì)胞因子,在特定誘導(dǎo)劑的作用下,由效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生并分泌,具有廣譜抗病毒活性、抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)免疫功能。按照國際通用的分類標(biāo)準(zhǔn),干擾素主要分為三大類,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中,IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素,而且Ⅱ型干擾素只包含IFN-γ—個(gè)成員。IFN-γ是由CD4+Th1、CD8+T細(xì)胞以及NK細(xì)胞受特異或非特異性抗原刺激后產(chǎn)生的糖蛋白,天然形式為N-糖基化的同源二聚體,具有一定的種屬特異性。IFN-γ除了具有抗病毒活性之外,還參與免疫調(diào)節(jié)和MHC(主要組織相容性復(fù)合體)抗原的表達(dá),也可以控制細(xì)胞生長。利用基因工程技術(shù)表達(dá)的干擾素與天然干擾素不僅在生物學(xué)活性方面高度相似,并且還具有純度高、產(chǎn)量大、同批次產(chǎn)物質(zhì)量穩(wěn)定一致、適合規(guī)�；I(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn);更加重要的是,通過基因工程技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)干擾素能夠大大降低經(jīng)濟(jì)成本,這一點(diǎn)對(duì)于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大面積推廣應(yīng)用干擾素非常有利。本研究中,利用基因工程技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、蛋白組學(xué)技術(shù)等相關(guān)技術(shù)獲得重組兔γ干擾素,研究其抗病毒功能以及制備單克隆抗體,為兔γ干擾素工業(yè)化生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。利用RT-PCR技術(shù)從ConA刺激后的家兔外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增兔γ干擾素(IFN-y)基因,獲得大小約為504bp左右的目的片段。然后將其克隆、轉(zhuǎn)化入pET-28a(+)原核表達(dá)載體上,構(gòu)建重組載體pET-28a-IFN-γ。將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)、HisTrap親和柱純化獲得大小約為18KDa左右的IFN-γ重組蛋白。大量表達(dá)重組兔IFN-γ蛋白,然后進(jìn)行蛋白復(fù)性,從而獲得有活性的IFN-γ蛋白。利用微量細(xì)胞病變抑制法測定重組兔IFN-γ蛋白的抗病毒效果。結(jié)果如下:(1)利用VERO細(xì)胞進(jìn)行測定,重組兔IFN-γ蛋白抗VSV活性為2.51x103U/mL,蛋白濃度為 0.556mg/mL,比活性是 4.51×103U/mg。(2)利用MDCK細(xì)胞進(jìn)行測定,重組兔IFN-y蛋白抗VSV活性為3.98×103U/mL,蛋白濃度為0.556mg/mL,比活性是7.16×103U/mg。結(jié)果表明,重組兔IFN-γ可以在體外抑制VSV對(duì)細(xì)胞的毒害作用。用純化的重組兔IFN-γ蛋白免疫BALB/C小鼠,制備脾細(xì)胞,與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,經(jīng)過篩選和克隆化,共獲得4株能穩(wěn)定分泌兔IFN-γ單克隆抗體(mAbs)的雜交瘤細(xì)胞株,分別被命名為3H8、4G4、4F10、6C12,亞型分別為IgG1、κ鏈,IgG2b、κ鏈,IgG1、κ鏈,IgG1、κ鏈。分別制備單抗腹水,4株單抗腹水的間接ELISA效價(jià)在10-4-10-5之間;Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示4株單抗均具有很好的特異性;相加ELISA試驗(yàn)顯示3H8和4F10針對(duì)一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn),4G4和6C12識(shí)別另一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)。家兔IFN-γ單克隆抗體的制備,為研究和檢測IFN-γ提供了一種重要的工具,也為研究家兔體內(nèi)的免疫機(jī)制和免疫功能奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:Interferon is a very important cytokine in human and other animals. It is produced and secreted by effector cells under the action of specific inducer. It has broad spectrum antiviral activity, antitumor activity and regulation of immune function. According to the international standard of classification, interferon is divided into three categories, I. e., type 鈪，

本文編號(hào)：2374531