【摘要】：鴿源禽毛滴蟲,簡(jiǎn)稱鴿毛滴蟲,是一種侵害鴿消化道上段的鞭毛原蟲,從而引起鴿毛滴蟲病,亦稱為“鴿癀”。鴿毛滴蟲可感染所有品種和月齡的鴿子,其中對(duì)幼鴿危害最大。鴿毛滴蟲病的特征是在鴿口腔、食道、嗉囊、前胃出現(xiàn)壞死性潰瘍,常造成患鴿呼吸道和上消化道梗阻,妨礙正常呼吸和進(jìn)食,繼而引發(fā)呼吸困難和饑餓,嚴(yán)重時(shí)造成宿主死亡。鴿毛滴蟲病是一種全球性疾病,具有高發(fā)性和廣泛流行性。藥物治療鴿毛滴蟲病有副作用,而且易產(chǎn)生抗藥蟲株。目前,亟需尋找安全有效的治療方法,而致病機(jī)制相關(guān)分子的研究就成為未來(lái)重要的研究方向,具有重要意義。對(duì)粘膜微生物致病菌而言,粘附宿主細(xì)胞是至關(guān)重要的過(guò)程。只有粘附于宿主細(xì)胞,才能進(jìn)行物理?yè)p傷、侵襲等一系列致病過(guò)程。粘附蛋白AP65是一種重要的滴蟲毒力基因,在多種粘附蛋白中有突出的作用。鴿毛滴蟲作為一種粘膜寄生蟲,粘附作用可能是其重要特性,AP65也可能是其重要粘附蛋白。鴿毛滴蟲潛在的表面毒力因子的探究,將為鴿毛滴蟲致病機(jī)制和基因工程疫苗的研究奠定分子基礎(chǔ),為有效防止鴿毛滴蟲病提供理論依據(jù)。本試驗(yàn)具體分為以下4部分:1.鴿毛滴蟲AP65序列的克隆測(cè)序本研究根據(jù)已知的陰道毛滴蟲AP65三個(gè)基因型序列設(shè)計(jì)引物,克隆獲得鴿毛滴蟲AP65部分序列,結(jié)合5’RACE PCR和3’RACE PCR獲取鴿毛滴蟲AP65兩端未知序列。通過(guò)試驗(yàn)和拼接分析獲得兩個(gè)基因型TgAP65-1(1766bp)、TgAP65-2(1759bp),ORF長(zhǎng)1704bp,編碼567個(gè)AA,上傳至GenBank獲得序列號(hào)KJ721787、KJ721788。2.鴿毛滴蟲AP65的序列分析對(duì)兩個(gè)基因型進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),兩者核酸同源性為94.22%,AA同源性達(dá)95.6%,并且差異主要存在于5’端。同時(shí),對(duì)鴿毛滴蟲AP65和陰道毛滴蟲AP65各基因型的同源性進(jìn)行了分析,同源性可達(dá)90.0%左右,同陰道毛滴蟲蘋果酸脫氫酶和氫化酶體蘋果酸酶高同源(80%)。鴿毛滴蟲TgAP65-1、TgAP65-2分別編碼一個(gè)大小為63057.81Da、63042.74Da的蛋白質(zhì),pI分別為8.15、8.48。通過(guò)生物信息學(xué)軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析預(yù)測(cè),并結(jié)合已知陰道毛滴蟲AP65結(jié)構(gòu)功能信息比較,我們發(fā)現(xiàn)鴿毛滴蟲AP65有短信號(hào)肽、無(wú)GPI、多個(gè)蛋白結(jié)合位點(diǎn)、兩個(gè)蘋果酸酶域,分別位于88-278,280-533位置。3.鴿毛滴蟲TgAP65-2重組蛋白多克隆抗體的制備構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9.0k-TgAP65-2,并采用氯化鋰轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中,甲醇誘導(dǎo)表達(dá),并用Ni柱純化。經(jīng)Western-blot鑒定表達(dá)的重組蛋白大小約為65KDa,與理論值相符。將純化后的重組鴿毛滴蟲AP65蛋白三次免疫BALB/c小鼠進(jìn)行多克隆抗體的制備。通過(guò)間接ELISA方法測(cè)定抗鴿毛滴蟲AP65抗體的效價(jià)后,將分離的小鼠血清作為多克隆抗體使用。4.鴿毛滴蟲自然表達(dá)AP65的鑒定及蟲體表面定位裂解蟲體進(jìn)行SDS-PAGE和Western-blot對(duì)鴿毛滴蟲自然表達(dá)的AP65進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示AP65為蟲體蛋白。通過(guò)間接免疫熒光檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)蟲體自然表達(dá)的AP65進(jìn)行蟲體表面定位,熒光顯微鏡下可見(jiàn)蟲體表面及鞭毛上都有熒光,但熒光較弱。
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【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2368058