【摘要】：植酸酶能水解植酸及植酸鹽,被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑。堿性植酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性、底物特異性及抗蛋白酶降解能力,不僅能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求,而且能適應(yīng)動(dòng)物腸道環(huán)境,是一種理想的飼料添加劑。但是,相對(duì)酸性植酸酶而言,堿性植酸酶最大的缺點(diǎn)是酶活較低,且在酸性環(huán)境中酶活受到嚴(yán)重抑制。因此,本研究首先通過(guò)定向進(jìn)化的方法提高堿性植酸酶在酸性及中性條件下的酶活；然后通過(guò)比較正向突變體在三種不同宿主茵(大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌)中的定向進(jìn)化規(guī)律及酶學(xué)性質(zhì),從而獲得具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的重組菌株。通過(guò)分子克隆的手段從枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)中獲得一個(gè)堿性植酸酶,并在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)其異源表達(dá)。通過(guò)比較不同的表達(dá)方式,最終確定了用于下一步定向進(jìn)化的重組菌構(gòu)建和誘導(dǎo)條件,即以pET30a為表達(dá)載體、酶切位點(diǎn)為BglⅡ和XhoⅠ、去除植酸酶基因中的信號(hào)肽序列、誘導(dǎo)表達(dá)溫度為25℃。然后以野生型堿性植酸酶基因?yàn)槟０�、以大腸桿菌BL21為表達(dá)宿主,通過(guò)兩輪的定向進(jìn)化、組合突變及飽和突變,獲得了D24G、D24G/K70R/K111E/N121S、 D24G/K265N等正向突變體。在37℃、pH 7.0反應(yīng)條件下,上述三株突變體的酶活比野生型分別提高了40.35%、52.06%、55.22%；在37℃、pH 4.5反應(yīng)條件下,則分別提高了76.61%、121.05%、84.21%。本研究考察了上述三種突變體的酶學(xué)性質(zhì),包括最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果顯示突變體和野生型具有相同的最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性,但三種突變體的溫度穩(wěn)定性均高于野生型；37℃、pH 7.0反應(yīng)條件下的總催化效率(Keat/Km)依次為野生型的2.32、2.31、2.10倍；而37℃、pH 4.5反應(yīng)條件下則分別是1.98、2.63、2.15倍。最后將酶活差距較大的突變體D24G、S51A、K265E、S51A/K265E、 D24G/K70R/K111E/N121S及野生型在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中實(shí)現(xiàn)分泌性表達(dá)。通過(guò)比較該堿性植酸酶的不同突變體在三種表達(dá)體系中的催化特性與酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)三種表達(dá)體系的定向進(jìn)化規(guī)律基本一致,在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)酶活高的突變體在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中一般也相應(yīng)較高。與大腸桿菌相比,在畢赤酵母中表達(dá)的野生型和突變體的酶活及最適反應(yīng)溫度均有所降低,D24G的最適反應(yīng)溫度從60℃降到55℃,而S51A則從60℃降到50℃,推測(cè)是由畢赤酵母中的糖基化現(xiàn)象引起�？赡苡捎诒狙芯恐械膲A性植酸酶基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌,在枯草芽孢桿菌WB800N中表達(dá)時(shí),突變體及野生型的酶活均有一定幅度的增加,37℃、pH 7.0反應(yīng)條件下,枯草芽孢桿菌表達(dá)的突變體D24G酶活比在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)提高了68.32%；而且D24G的最適反應(yīng)溫度從60℃上升到65℃。綜上所述,枯草芽孢桿菌更適合用于此堿性植酸酶突變體的表達(dá)及工業(yè)化生產(chǎn)。本文通過(guò)定向進(jìn)化方法得到了在酸性及中性條件下酶活提高的突變株,并通過(guò)三種表達(dá)體系之間的比較,確定了最優(yōu)的堿性植酸酶表達(dá)宿主菌,為進(jìn)一步探索和提高堿性植酸酶酶活使其更適用于工業(yè)化生產(chǎn)奠定了一定的基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S816.7;Q814.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 阮靜;劉曉s，

本文編號(hào)：2366366