【摘要】：植酸酶能水解植酸及植酸鹽,被廣泛應用于飼料添加劑。堿性植酸酶具有較高的熱穩(wěn)定性、底物特異性及抗蛋白酶降解能力,不僅能夠滿足工業(yè)化生產要求,而且能適應動物腸道環(huán)境,是一種理想的飼料添加劑。但是,相對酸性植酸酶而言,堿性植酸酶最大的缺點是酶活較低,且在酸性環(huán)境中酶活受到嚴重抑制。因此,本研究首先通過定向進化的方法提高堿性植酸酶在酸性及中性條件下的酶活；然后通過比較正向突變體在三種不同宿主茵(大腸桿菌、畢赤酵母、枯草芽孢桿菌)中的定向進化規(guī)律及酶學性質,從而獲得具有工業(yè)化應用潛力的重組菌株。通過分子克隆的手段從枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)中獲得一個堿性植酸酶,并在大腸桿菌BL21中實現(xiàn)其異源表達。通過比較不同的表達方式,最終確定了用于下一步定向進化的重組菌構建和誘導條件,即以pET30a為表達載體、酶切位點為BglⅡ和XhoⅠ、去除植酸酶基因中的信號肽序列、誘導表達溫度為25℃。然后以野生型堿性植酸酶基因為模板、以大腸桿菌BL21為表達宿主,通過兩輪的定向進化、組合突變及飽和突變,獲得了D24G、D24G/K70R/K111E/N121S、 D24G/K265N等正向突變體。在37℃、pH 7.0反應條件下,上述三株突變體的酶活比野生型分別提高了40.35%、52.06%、55.22%；在37℃、pH 4.5反應條件下,則分別提高了76.61%、121.05%、84.21%。本研究考察了上述三種突變體的酶學性質,包括最適pH、最適溫度、pH穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及動力學參數(shù),結果顯示突變體和野生型具有相同的最適反應溫度、最適反應pH及pH穩(wěn)定性,但三種突變體的溫度穩(wěn)定性均高于野生型；37℃、pH 7.0反應條件下的總催化效率(Keat/Km)依次為野生型的2.32、2.31、2.10倍；而37℃、pH 4.5反應條件下則分別是1.98、2.63、2.15倍。最后將酶活差距較大的突變體D24G、S51A、K265E、S51A/K265E、 D24G/K70R/K111E/N121S及野生型在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中實現(xiàn)分泌性表達。通過比較該堿性植酸酶的不同突變體在三種表達體系中的催化特性與酶學性質,發(fā)現(xiàn)三種表達體系的定向進化規(guī)律基本一致,在大腸桿菌中表達時酶活高的突變體在畢赤酵母GS115和枯草芽孢桿菌WB800N中一般也相應較高。與大腸桿菌相比,在畢赤酵母中表達的野生型和突變體的酶活及最適反應溫度均有所降低,D24G的最適反應溫度從60℃降到55℃,而S51A則從60℃降到50℃,推測是由畢赤酵母中的糖基化現(xiàn)象引起。可能由于本研究中的堿性植酸酶基因來源于枯草芽孢桿菌,在枯草芽孢桿菌WB800N中表達時,突變體及野生型的酶活均有一定幅度的增加,37℃、pH 7.0反應條件下,枯草芽孢桿菌表達的突變體D24G酶活比在大腸桿菌中表達時提高了68.32%；而且D24G的最適反應溫度從60℃上升到65℃。綜上所述,枯草芽孢桿菌更適合用于此堿性植酸酶突變體的表達及工業(yè)化生產。本文通過定向進化方法得到了在酸性及中性條件下酶活提高的突變株,并通過三種表達體系之間的比較,確定了最優(yōu)的堿性植酸酶表達宿主菌,為進一步探索和提高堿性植酸酶酶活使其更適用于工業(yè)化生產奠定了一定的基礎。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S816.7;Q814.9

【參考文獻】

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1 阮靜;劉曉s，

本文編號：2366366