【摘要】：2014年以來,在我國許多櫻桃谷肉鴨養(yǎng)殖地區(qū)廣泛流行一種“鴨大舌病”,其臨床癥狀主要表現(xiàn)為鴨生長發(fā)育遲緩,鴨喙萎縮舌頭外露下垂,跛行癱瘓等,又稱鴨短喙-侏儒綜合征。已經(jīng)鑒定出該病的病原是一種新型鴨細小病毒(Novel duck parvovirus,NDPV)。目前對此病毒的生物學(xué)特性暫不清楚,臨床上還沒有有效的疫苗或藥物行防治,也沒有檢測該病毒的方法或技術(shù)。為此,本研究對NDPV DS-15株的生物學(xué)特性進行了研究,同時為了給該病的流行病學(xué)調(diào)查提供一個可靠的檢測方法,我們還對NDPV的主要抗原蛋白VP3進行了表達和純化,并在此基礎(chǔ)上建立了檢測NDPV抗體的ELISA方法。首先,我們對新型鴨細小病毒DS-15株在鴨胚上的增殖特性及對鴨胚的致病力進行研究。試驗結(jié)果顯示,鴨胚接種NDPV DS-15株以后,96~120 h出現(xiàn)死亡,胚體全身出血,病毒滴度(ELD50)為10-5.5/0.2 mL。以鴨胚增殖的病毒感染櫻桃谷肉鴨,成功復(fù)制出典型的“鴨大舌病”臨床癥狀,并從發(fā)病鴨臟器中分離到病毒。其次,根據(jù)NDPV DS-15株的基因序列設(shè)計PCR引物擴增VP3基因并將其序列與國內(nèi)外報道的部分GPV及MDPV分離株的VP3基因進行比對和分析。結(jié)果表明,NDPV DS-15株VP3基因與鵝細小病毒(Goose parvovirus,GPV)之間的核苷酸和氨基酸同源性分別為91.4%~98.4%和96.6%~98.1%,而與番鴨細小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)核苷酸和氨基酸同源性則較低,分別為81.4%~91.5%和91%~97%;在親緣關(guān)系方面,NDPV DS-15株與GPV較近,提示二者可能是由同一病毒進化而來。最后,我們將NDPV的VP3基因克隆并插入到pGEX-4T-1中構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-VP3,誘導(dǎo)表達重組GST-VP3蛋白,重組蛋白分子量為84kDa。Western blot方法檢測結(jié)果顯示重組VP3蛋白能與NDPV多克隆抗體發(fā)生反應(yīng),重組VP3蛋白具備用作診斷抗原的潛力。以表達的VP3蛋白作為抗原,包被ELISA板;然后,分別對包被抗原的濃度及條件、抗原封閉條件、一抗的孵育條件、酶標(biāo)二抗的孵育條件和顯色條件等進行優(yōu)化,最終成功建立間接ELISA方法,確定方法的陽性閾值為0.35。所建立的方法有較好的重復(fù)性,運用該方法對臨床樣本進行了初步檢測,結(jié)果表明該方法可用于NDPV疫苗的免疫效力評價,及NDPV感染鴨群的流行病學(xué)調(diào)查,同時也可用于鴨群GPV的檢測。綜上,本論文對NDPV的增殖特性及致病特性進行了初步研究,推測新型鴨細小病毒與鵝細小病毒可能是從同一病毒祖先進化而來。此外,我們建立了檢測NDPV抗體的間接ELISA方法,為開展NDPV的疫苗研發(fā)和流行病學(xué)調(diào)查等提供了可靠的檢測方法。
[Abstract]:Since 2014, a kind of "duck hyoid disease" has been prevalent in many cherry valley meat duck breeding areas in China. Its clinical symptoms mainly include duck growth retardation, duck beak atrophy tongue protruding, claudication paralysis and so on. Also known as duck short beak-dwarf syndrome. The pathogen of the disease has been identified as a new type of duck parvovirus (Novel duck parvovirus,NDPV). At present, the biological characteristics of the virus are not clear, there is no effective vaccine or drugs to prevent and cure the virus, and there is no method or technology to detect the virus. In order to provide a reliable method for the epidemiological investigation of NDPV DS-15, we also expressed and purified VP3, the main antigen protein of NDPV. On this basis, a ELISA method for detection of NDPV antibody was established. Firstly, we studied the proliferation and pathogenicity of a novel duck parvovirus DS-15 strain on duck embryos. The results showed that the duck embryo died at 96120 h after inoculation with NDPV DS-15 strain, the embryo body was bleeding and the virus titer (ELD50) was 10-5.5 / 0.2 mL.. The typical clinical symptoms of "duck hyoid disease" were successfully duplicated and the virus was isolated from the infected duck organs after infecting Cherry Valley Meat Duck with duck embryo proliferating virus. Secondly, according to the gene sequence of NDPV DS-15 strain, PCR primers were designed to amplify the VP3 gene, and the VP3 gene was compared and analyzed with the VP3 gene of some GPV and MDPV isolates reported at home and abroad. The results showed that the nucleotide and amino acid homology between VP3 gene of NDPV DS-15 strain and goose parvovirus (Goose parvovirus,GPV) was 91.4% and 96.698. 1%, respectively, and 91.4% and 96. 6% with muscovy duck parvovirus (Muscovy duck parvovirus,), respectively. The nucleotide and amino acid homology of MDPV was 81.4% and 91.5%, respectively. The close relationship between NDPV DS-15 strain and GPV suggests that the two strains may have evolved from the same virus. Finally, we cloned the VP3 gene of NDPV and inserted it into pGEX-4T-1 to construct the recombinant expression plasmid pGEX-4T-VP3, to induce the expression of recombinant GST-VP3 protein. The molecular weight of the recombinant protein was determined by 84kDa.Western blot method. The results showed that the recombinant VP3 protein could react with NDPV polyclonal antibody, and the recombinant VP3 protein had the potential to be used as diagnostic antigen. The expressed VP3 protein was used as antigen and coated with ELISA plate. Then, the concentration and condition of coated antigen, the condition of antigen sealing, the incubation condition of first antibody, the incubation condition of enzyme labeled second antibody and the condition of color development were optimized, and the indirect ELISA method was established successfully. The positive threshold of the method is 0.35. The results showed that the method could be used to evaluate the immune efficacy of NDPV vaccine and to investigate the epidemiology of NDPV infected ducks. It can also be used for the detection of GPV in ducks. In summary, the proliferation and pathogenicity of NDPV were studied preliminarily, and it was inferred that the new duck parvovirus and goose parvovirus might have evolved from the same virus ancestor. In addition, we established an indirect ELISA method for the detection of NDPV antibodies, which provided a reliable method for the development of NDPV vaccine and epidemiological investigation.
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S852.65

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本文編號：2360932