【摘要】：禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)引起的雞的腫瘤性疾病。它可以使雞直接發(fā)病,產(chǎn)生腫瘤而死亡;也可以導(dǎo)致感染雞產(chǎn)生免疫抑制,繼發(fā)多種病原的混合感染,使病雞對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力下降,嚴(yán)重影響雞的生產(chǎn)性能。2008年以來,禽白血病尤其是J亞群禽白血病在我國(guó)大部分省份不同程度的爆發(fā)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。禽白血病目前沒有有效的防治措施。預(yù)防本病的主要方法是淘汰陽性雞,凈化種群。因此利用群特異性或亞群特異性單克隆抗體(Monoclonal Antibody,MAb)建立ALV抗原診斷方法對(duì)于臨床上ALV的診斷凈化、防控、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)等具有重要意義。p27蛋白作為ALV的群特異性抗原,因其序列高度保守并且含有許多易于被檢測(cè)的抗原位點(diǎn)而成為制備檢測(cè)抗體的首選抗原。本研究首先對(duì)p27蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與純化,利用雜交瘤技術(shù)制備了針對(duì)p27蛋白的4株MAb,分別命名為3A9、2E5、3D5、3H12。然后利用肽掃描(Pepscan)技術(shù)對(duì)p27蛋白的表位信息進(jìn)行分析,得到一個(gè)線性p27蛋白表位181PPSAR185,該表位在ALV各個(gè)亞群之間高度保守,是群特異性表位。以制備的MAb 2E5作為捕獲抗體,MAb 3D5作為檢測(cè)抗體建立了禽白血病病毒群特異性抗原ELISA檢測(cè)方法。通過對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件的優(yōu)化,確立了該方法的最佳程序。該方法特異性好,可與家禽常見的A、B和J亞群ALV反應(yīng),但不與其他禽病病原如NDV、IBDV、MDV、AIV等反應(yīng)。該方法對(duì)重組p27蛋白的最低檢測(cè)量為1.25ng/m L,敏感性略高于美國(guó)IDEXX Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit(ALV Ag)試劑盒。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明,同一樣品的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%。保存期實(shí)驗(yàn)表明,該試劑盒在4℃保存一年后對(duì)陰陽性樣品的檢測(cè)結(jié)果仍然具有良好的穩(wěn)定性。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)研制的試劑盒與美國(guó)IDEXX試劑盒對(duì)2555份泄殖腔拭子檢測(cè)結(jié)果的總符合率為96.32%;對(duì)1141份蛋清樣品檢測(cè)結(jié)果的總符合率為97.20%。人工感染實(shí)驗(yàn)表明,PCR檢測(cè)方法最早檢出陽性結(jié)果為攻毒后11日,本實(shí)驗(yàn)研制的ELISA檢測(cè)試劑盒最早檢出陽性結(jié)果為攻毒后12日。gp85蛋白在ALV各亞群之間具有高度的變異性,同源性很低,約為30%,具有亞群特異性。本研究首先對(duì)gp85蛋白進(jìn)行原核表達(dá)與純化,制備了針對(duì)這個(gè)蛋白的MAb,命名為4A3。MAb 4A3不能與ALV-A和ALV-B反應(yīng),但是能夠與不同國(guó)家、時(shí)間、地域分離的ALV-J毒株發(fā)生特異性反應(yīng)。然后利用肽掃描(Pepscan)技術(shù)鑒定出gp85蛋白的一個(gè)線性表位134AEAELRDFI142,該表位在不同的ALV-J毒株之間高度保守,是亞群特異性表位。針對(duì)gp85蛋白的MAb和表位的研究為接下來建立以MAb為基礎(chǔ)的J亞群ALV抗原診斷方法奠定了良好的基礎(chǔ)。本研究共得到4株抗p27蛋白和1株抗ALV-J gp85蛋白的MAbs,鑒定出1個(gè)p27蛋白抗原表位和1個(gè)gp85蛋白抗原表位,為進(jìn)一步研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能提供了有利的工具。利用MAb 2E5和3D5建立了禽白血病病毒群特異性抗原ELISA檢測(cè)方法,該方法特異性好、敏感性高、與其它檢測(cè)方法符合率高,可用于臨床中禽白血病病毒的診斷、檢測(cè)和種群凈化。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S855.3

【參考文獻(xiàn)】

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3 王峰;劉青;王曉偉;陳洪博;于琳琳;王s，

本文編號(hào)：2361215