【摘要】：母系胚胎亮氨酸拉鏈激酶(MELK,maternal embryonic leucine zipper kinase),參與廣泛的細(xì)胞變化過(guò)程,如細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖過(guò)程等。MELK蛋白N端的催化結(jié)構(gòu)域是該蛋白的最主要活性部位,但是受UBA和TP-rich結(jié)構(gòu)域的制約。在乳腺癌細(xì)胞中MELK可以直接磷酸化BCL-GL,抑制BCL-GL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用,進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活和增殖。本實(shí)驗(yàn)室已克隆出豬MELK(pMELK)和豬BCL-G(pBCL-G)基因,并通過(guò)免疫共沉淀證明pMELK能與pBCL-G相互作用。本論文運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)著重研究了pMELK對(duì)pBCL-G介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。研究結(jié)果如下:1、本實(shí)驗(yàn)將pMELK和pMELK催化功能域(catalytic domian,cd)部分分別連接到pEGFP-C1真核表達(dá)載體,構(gòu)建重組載體pEGFP-pMELK和pEGFP-cd。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染。通過(guò)熒光顯微鏡觀察和western blot鑒定了融合蛋白GFP-pMELK和GFP-cd的表達(dá)。2、瞬時(shí)過(guò)表達(dá)GFP-pMELK蛋白或GFP-cd蛋白的細(xì)胞用星孢菌素(STS)誘導(dǎo)處理后,光學(xué)顯微鏡下觀察均出現(xiàn)了細(xì)胞變圓,皺縮,脫落,體積變小等細(xì)胞凋亡的特征。用Hoechst33342染色后,STS誘導(dǎo)處理的細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝聚等細(xì)胞凋亡的典型現(xiàn)象。用Annexin V-PE與PI對(duì)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)GFP-pMELK或GFP-cd蛋白的細(xì)胞進(jìn)行雙重染色,同時(shí)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析,單獨(dú)過(guò)表達(dá)GFP-pMELK蛋白或GFP-cd對(duì)STS(500nM)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡影響不顯著。說(shuō)明pMELK蛋白和單獨(dú)的催化功能域部分對(duì)細(xì)胞凋亡的影響一致。本實(shí)驗(yàn)將pCMV-HA-pMELK載體轉(zhuǎn)染至穩(wěn)定表達(dá)GFP-pBCL-G蛋白的細(xì)胞中,用500nMSTS誘導(dǎo)18h,收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析,得出pMELK對(duì)pBCL-G介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。
[Abstract]:Maternal embryo leucine zipper kinase (MELK,maternal embryonic leucine zipper kinase),) is involved in a wide range of cellular processes, such as cell apoptosis and cell proliferation. The N-terminal catalytic domain of MELK protein is the main active site of the protein. However, it is restricted by UBA and TP-rich domains. In breast cancer cells, MELK can directly phosphorylate BCL-GL, and inhibit apoptosis mediated by BCL-GL, thus promoting the survival and proliferation of breast cancer cells. Porcine MELK (pMELK) and porcine BCL-G (pBCL-G) genes were cloned in our laboratory, and the interaction between pMELK and pBCL-G was proved by immunoprecipitation. In this paper, flow cytometry was used to study the effect of pMELK on apoptosis mediated by pBCL-G. The results are as follows: 1. The part of pMELK and pMELK catalytic functional domain (catalytic domian,cd) were ligated to pEGFP-C1 eukaryotic expression vector respectively, and the recombinant vectors pEGFP-pMELK and pEGFP-cd. were constructed. The transfection was carried out by liposome method. The expression of GFP-pMELK and GFP-cd was identified by fluorescence microscope and western blot. 2. The cells which expressed GFP-pMELK or GFP-cd protein were treated with (STS). Cell apoptosis was observed under optical microscope, such as round cell, shrinkage, shedding and small volume. After Hoechst33342 staining, STS induced apoptosis of cells, such as nuclear condensation and chromatin condensation. Annexin V-PE and PI were used for double staining of transient overexpression of GFP-pMELK or GFP-cd protein. Combined with flow cytometry analysis, the expression of GFP-pMELK or GFP-cd alone had no significant effect on STS (500nM) -induced apoptosis. The results showed that the effect of pMELK protein on apoptosis was consistent with that of the single catalytic domain. In this study, the pCMV-HA-pMELK vector was transfected into the cells stably expressing GFP-pBCL-G protein, and the cells were induced by 500nMSTS for 18 h. The results of flow cytometry showed that pMELK could inhibit the apoptosis induced by pBCL-G.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.2

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本文編號(hào)：2350311