【摘要】：禽流感(Avian Influenza,AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的綜合性傳染疾病。H9N2為家禽低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)亞型之一,最早于1966年提取自北美的火雞,我國(guó)自1994年在廣東從雞中分離出。H9N2亞型禽流感一直是我國(guó)禽流感流行的主型,并廣泛存在于我國(guó)大部分地區(qū),是威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的最主要疾病之一。大量研究及本課題組前期試驗(yàn)已證實(shí),H9N2亞型AIV主要影響家禽的呼吸、消化及生殖系統(tǒng)功能,且出現(xiàn)一些神經(jīng)癥狀和神經(jīng)損傷。對(duì)流感病毒的神經(jīng)癥狀機(jī)理的研究,多以小鼠為模型,證實(shí)流感病毒可感染其腦組織,而禽類感染H9N2 AIV后對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的致病性及其機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。為了揭示雞感染H9N2 AIV后在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的病毒分布情況及引起的免疫應(yīng)答,本研究用H9N2亞型AIV人工滴鼻感染70日齡無(wú)特定病原(Specific Pathogen Free,SPF)雞,分別采用直接免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)了不同感染時(shí)間雞大腦和小腦中核蛋白(Nucleoprotein,NP)的分布、免疫相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。獲得以下主要試驗(yàn)結(jié)果:1.人工感染H9N2亞型AIV雞模型的建立SPF雞30只,其中25只滴鼻接種H9N2AIV病毒原液3 mL,其余5只為空白對(duì)照組。在感染第2 d、4 d、6 d、8 d、15 d隨機(jī)選取人工感染雞5只,采取腦組織。通過(guò)絕對(duì)定量法檢測(cè)出H9N2 AIV的M基因的CT值,根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大、小腦的病毒載量;采用免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)感染H9N2 AIV雞腦組織中NP蛋白的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn),H9N2 AIV在感染第4 d病毒含量最高,其中大腦為1269.685copies/0.1g、小腦為804.67copies/0.1g;在感染第15 d后恢復(fù)健康,對(duì)照組未檢測(cè)到病毒載量。在大腦,NP蛋白主要分布在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中,部分細(xì)胞核中也有分布;在小腦,NP蛋白主要分布在顆粒層及分子層中神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中;在感染第4 d腦中NP蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最多,與病毒載量的表達(dá)趨勢(shì)相一致。表明成功建立人工感染H9N2亞型AIV雞模型,且病毒可在腦中復(fù)制。2.感染H9N2 AIV雞腦組織中免疫相關(guān)基因mRNA的表達(dá)Real-time PCR檢測(cè)感染H9N2 AIV雞腦組織中Toll樣受體(TLR3/TLR4/TLR7/TLR21)、MDA-5、細(xì)胞因子(IL-2/IL-6/IFN-α/IFN-β)、趨化因子及受體(CXCLi1/CXCLi2/XCL1/XCR1/CCR5)及抑炎性因子(IL-4/IL-10/TGF-β1/TGF-β2)的mRNA含量。結(jié)果顯示,TLR3/7/21及MDA-5基因在腦組織中的含量在第2 d呈上調(diào)趨勢(shì),TLR21基因在第4 d較對(duì)照組極顯著上調(diào)(P0.001);IL-2基因在第4 d極顯著上調(diào)(P0.001),其后表達(dá)水平下降;而IL-6/IFN-α/IFN-β基因表達(dá)含量在感染前4 d升高但較對(duì)照組差異不顯著(P㧐0.05),在第6 d出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì);CXCLi1、CXCLi2、XCL1、XCR1、CCR5在感染初期都表現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì),其中XCL1及XCR1上調(diào)趨勢(shì)較對(duì)照組極顯著(P0.001)。IL-4在第2 d出現(xiàn)極顯著上調(diào)的趨勢(shì)(P0.001),其后表達(dá)水平下降;TGF在腦組織中出現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì),但較對(duì)照組差異不顯著(P㧐0.05)。其中大腦的免疫相關(guān)基因表達(dá)變化趨勢(shì)較小腦規(guī)律,在大腦和小腦中隨著不同感染時(shí)間呈現(xiàn)出不同程度的表達(dá)變化,具體表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。3.感染H9N2 AIV雞腦組織中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè)發(fā)現(xiàn),雞感染H9N2 AIV后,大腦、小腦組織CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞的數(shù)量隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增多,且感染組明顯多于對(duì)照組,在感染第4 d和第6 d數(shù)量達(dá)到最多;其中大腦中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞分布較散,在小腦中兩種淋巴細(xì)胞主要集中在顆粒層。這兩種淋巴細(xì)胞在腦組織中的數(shù)量存在差異,CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞明顯多于CD3+CD4+,表明CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞可能在炎癥發(fā)生及病毒清除中發(fā)揮主要作用。以上結(jié)果表明,人工感染的H9N2亞型AIV能在雞腦組織中存活復(fù)制,感染呈一定時(shí)間和部位相關(guān)性地引起雞腦組織免疫相關(guān)基因mRNA的表達(dá)以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。為揭示雞腦組織感染H9N2 AIV產(chǎn)生的神經(jīng)癥狀、病理變化及免疫應(yīng)答機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S858.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 王軍政;王開(kāi);張寧寧;高玉偉;胡桂學(xué);;鴨源H5N5和H5N1亞型禽流感病毒BALB/c鼠感染試驗(yàn)[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年12期

2 劉興旺;劉強(qiáng);;禽流感的臨床特征及疫苗防治[J];吉林畜牧獸醫(yī);2014年11期

3 王家敏;沈武玲;于國(guó)偉;;禽流感研究進(jìn)展[J];吉林農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年05期

4 周健祥;王革非;蔣治武;曾俊;蘇蕓;李康生;;流感病毒誘導(dǎo)小鼠膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2012年01期

5 鄭世民;高雪麗;劉超男;劉明;;H5N1禽流感病毒感染雛雞免疫器官細(xì)胞因子的變化[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2010年06期

6 ;Apoptosis and Proinflammatory Cytokine Responses of Primary Mouse Microglia and Astrocytes Induced by Human H1N1 and Avian H5N1 Influenza Viruses[J];Cellular & Molecular Immunology;2008年02期

7 宋金祥;范春艷;劉穎;;H9N2亞型禽流感的病理組織學(xué)變化[J];養(yǎng)禽與禽病防治;2007年12期

8 陳伯倫，張澤紀(jì)，，陳偉斌;禽流感研究I．雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定[J];中國(guó)獸醫(yī)雜志;1994年10期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 王瑞存;H9N2亞型AIV感染雞腦組織損傷及細(xì)胞凋亡的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 王增;H5N1亞型禽流感病毒強(qiáng)弱毒株感染家鴨腦內(nèi)蛋白表達(dá)差異性分析[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

本文編號(hào)：2334992