【摘要】：禽流感(Avian Influenza,AI)是由正黏病毒科、流感病毒屬的禽流感病毒(Avian Influenza Virus,AIV)引起的綜合性傳染疾病。H9N2為家禽低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)亞型之一,最早于1966年提取自北美的火雞,我國自1994年在廣東從雞中分離出。H9N2亞型禽流感一直是我國禽流感流行的主型,并廣泛存在于我國大部分地區(qū),是威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的最主要疾病之一。大量研究及本課題組前期試驗已證實,H9N2亞型AIV主要影響家禽的呼吸、消化及生殖系統(tǒng)功能,且出現(xiàn)一些神經(jīng)癥狀和神經(jīng)損傷。對流感病毒的神經(jīng)癥狀機理的研究,多以小鼠為模型,證實流感病毒可感染其腦組織,而禽類感染H9N2 AIV后對神經(jīng)系統(tǒng)的致病性及其機理的研究鮮有報道。為了揭示雞感染H9N2 AIV后在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System,CNS)的病毒分布情況及引起的免疫應答,本研究用H9N2亞型AIV人工滴鼻感染70日齡無特定病原(Specific Pathogen Free,SPF)雞,分別采用直接免疫熒光、實時熒光定量PCR和免疫熒光雙標記法檢測了不同感染時間雞大腦和小腦中核蛋白(Nucleoprotein,NP)的分布、免疫相關基因mRNA的表達變化以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細胞浸潤情況。獲得以下主要試驗結果:1.人工感染H9N2亞型AIV雞模型的建立SPF雞30只,其中25只滴鼻接種H9N2AIV病毒原液3 mL,其余5只為空白對照組。在感染第2 d、4 d、6 d、8 d、15 d隨機選取人工感染雞5只,采取腦組織。通過絕對定量法檢測出H9N2 AIV的M基因的CT值,根據(jù)實驗室已建立的標準曲線計算大、小腦的病毒載量;采用免疫熒光雙標檢測感染H9N2 AIV雞腦組織中NP蛋白的分布。結果發(fā)現(xiàn),H9N2 AIV在感染第4 d病毒含量最高,其中大腦為1269.685copies/0.1g、小腦為804.67copies/0.1g;在感染第15 d后恢復健康,對照組未檢測到病毒載量。在大腦,NP蛋白主要分布在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞的胞質中,部分細胞核中也有分布;在小腦,NP蛋白主要分布在顆粒層及分子層中神經(jīng)元的細胞質中;在感染第4 d腦中NP蛋白陽性細胞數(shù)最多,與病毒載量的表達趨勢相一致。表明成功建立人工感染H9N2亞型AIV雞模型,且病毒可在腦中復制。2.感染H9N2 AIV雞腦組織中免疫相關基因mRNA的表達Real-time PCR檢測感染H9N2 AIV雞腦組織中Toll樣受體(TLR3/TLR4/TLR7/TLR21)、MDA-5、細胞因子(IL-2/IL-6/IFN-α/IFN-β)、趨化因子及受體(CXCLi1/CXCLi2/XCL1/XCR1/CCR5)及抑炎性因子(IL-4/IL-10/TGF-β1/TGF-β2)的mRNA含量。結果顯示,TLR3/7/21及MDA-5基因在腦組織中的含量在第2 d呈上調趨勢,TLR21基因在第4 d較對照組極顯著上調(P0.001);IL-2基因在第4 d極顯著上調(P0.001),其后表達水平下降;而IL-6/IFN-α/IFN-β基因表達含量在感染前4 d升高但較對照組差異不顯著(P㧐0.05),在第6 d出現(xiàn)下調的趨勢;CXCLi1、CXCLi2、XCL1、XCR1、CCR5在感染初期都表現(xiàn)出上調的趨勢,其中XCL1及XCR1上調趨勢較對照組極顯著(P0.001)。IL-4在第2 d出現(xiàn)極顯著上調的趨勢(P0.001),其后表達水平下降;TGF在腦組織中出現(xiàn)下調的趨勢,但較對照組差異不顯著(P㧐0.05)。其中大腦的免疫相關基因表達變化趨勢較小腦規(guī)律,在大腦和小腦中隨著不同感染時間呈現(xiàn)出不同程度的表達變化,具體表現(xiàn)為時間依賴性。3.感染H9N2 AIV雞腦組織中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細胞浸潤情況檢測發(fā)現(xiàn),雞感染H9N2 AIV后,大腦、小腦組織CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細胞的數(shù)量隨感染時間的延長而逐漸增多,且感染組明顯多于對照組,在感染第4 d和第6 d數(shù)量達到最多;其中大腦中CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細胞分布較散,在小腦中兩種淋巴細胞主要集中在顆粒層。這兩種淋巴細胞在腦組織中的數(shù)量存在差異,CD3+CD8α+淋巴細胞明顯多于CD3+CD4+,表明CD3+CD8α+淋巴細胞可能在炎癥發(fā)生及病毒清除中發(fā)揮主要作用。以上結果表明,人工感染的H9N2亞型AIV能在雞腦組織中存活復制,感染呈一定時間和部位相關性地引起雞腦組織免疫相關基因mRNA的表達以及CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細胞的浸潤。為揭示雞腦組織感染H9N2 AIV產(chǎn)生的神經(jīng)癥狀、病理變化及免疫應答機制提供了一定的理論基礎。
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【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S858.31

【參考文獻】

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本文編號：2334992