【摘要】：卵丘細(xì)胞作為顆粒細(xì)胞的一種，其在卵母細(xì)胞成熟過程中的擴(kuò)張狀態(tài)以及凋亡比率對卵母細(xì)胞的成熟具有重要作用。已有研究表明，BMP15、IGF-I與FSH均可影響其增殖、生長與分化，，從而影響卵母細(xì)胞正常生長和成熟。JMJD1C是KDM3家族中的一員，其中KDM3A、KDM3B即JMJD1A、JMJD1B能夠特異去除H3K9me1與H3K9me2的甲基化修飾，但JMJD1C是否也具有對H3K9的催化作用或活性，且在BMP15、IGF-I、FSH介導(dǎo)下對卵丘細(xì)胞增殖與凋亡的影響則罕有報(bào)道。 為明確JMJD1C對H3K9的去甲基化作用，本研究在對牛卵丘細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)后，利用RNAi方法抑制JMJD1C的表達(dá)，并通過免疫熒光方法檢測H3K9me1、H3K9me2的表達(dá)變化。結(jié)果表明：對牛卵丘細(xì)胞中JMJD1C mRNA表達(dá)成功地進(jìn)行抑制后，H3K9me1、H3K9me2表達(dá)量無明顯變化，即JMJD1C對去除H3K9me1與H3K9me2的甲基化修飾均并無明顯作用。 為檢測BMP15、IGF-I和FSH對JMJD1C表達(dá)的影響，分別在培養(yǎng)液中添加不同濃度BMP15、IGF-I和FSH并檢測JMJD1C的表達(dá)變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，添加FSH和IGF-1對JMJD1C的mRNA表達(dá)水平無顯著影響；而50ng/ml與100ng/ml的BMP15添加會(huì)顯著降低JMJD1C的mRNA表達(dá)水平（p㩳0.01）。MTS細(xì)胞增殖檢測結(jié)果也表明，BMP15的添加量為50ng/ml時(shí)，可明顯促進(jìn)卵丘細(xì)胞增殖，即BMP15的添加濃度為50ng/ml時(shí)顯著抑制了JMJD1C的表達(dá)并促進(jìn)了卵丘細(xì)胞增殖。因此進(jìn)一步選取添加量為50ng/mlBMP15探究JMJD1C在BMP15介導(dǎo)下對卵丘細(xì)胞凋亡與增殖的影響。 基于以上結(jié)果，利用siRNA敲減JMJD1C基因的表達(dá)，同時(shí)從mRNA水平和蛋白水平檢測凋亡標(biāo)記基因Bcl2和Bax表達(dá)量變化。實(shí)時(shí)熒光定量PCR與Western Blot結(jié)果均表明，BMP15添加后沉默JMJD1C基因，凋亡標(biāo)記基因Bcl2與Bax的比值都明顯升高，即卵丘細(xì)胞的凋亡率降低。表明了BMP15與JMJD1C之間的間接聯(lián)系可以影響卵丘細(xì)胞的凋亡，JMJD1C可抑制卵丘細(xì)胞中BMP15介導(dǎo)的抗凋亡作用。 綜上所述，本研究明確了牛卵丘細(xì)胞中JMJD1C在mRNA水平上不具有直接調(diào)控組蛋白H3K9me1、H3K9me2的去甲基化作用，而JMJD1C可影響B(tài)MP15在牛卵丘細(xì)胞中介導(dǎo)的抗凋亡作用。研究結(jié)果有助于識(shí)別KDM3密切相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的差別，對JMJD1C的功能進(jìn)行了新的探究并為揭示卵丘細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。
[Abstract]:As one of granulosa cells, cumulus cells play an important role in oocyte maturation. Studies have shown that both BMP15,IGF-I and FSH can affect the proliferation, growth and differentiation of oocytes, thus affecting the normal growth and maturation of oocytes. JMJD1C is a member of the KDM3 family, in which KDM3A,KDM3B is JMJD1A,. JMJD1B can specifically remove the methylation modification of H3K9me1 and H3K9me2, but whether JMJD1C also has the catalytic effect or activity on H3K9, and the effect of BMP15,IGF-I,FSH on the proliferation and apoptosis of cumulus cells is rarely reported. In order to clarify the demethylation effect of JMJD1C on H3K9, the expression of JMJD1C was inhibited by RNAi method after cultured bovine cumulus cells in vitro, and the expression of H3K9me1, H3K9me2 was detected by immunofluorescence. The results showed that after successfully inhibiting the expression of JMJD1C mRNA in bovine cumulus cells, the expression of H3K9me1 and H3K9me2 did not change significantly, that is, JMJD1C had no significant effect on the removal of methylation modification of H3K9me1 and H3K9me2. In order to detect the effect of BMP15,IGF-I and FSH on the expression of JMJD1C, different concentrations of BMP15,IGF-I and FSH were added to the culture medium and the expression of JMJD1C was detected. The addition of FSH and IGF-1 had no significant effect on the mRNA expression of JMJD1C. BMP15 addition of 50ng/ml and 100ng/ml significantly decreased the mRNA expression level of JMJD1C (pp0.01). MTS cell proliferation test also showed that the addition of BMP15 to 50ng/ml could significantly promote the proliferation of cumulus cells. The addition of BMP15 to 50ng/ml significantly inhibited the expression of JMJD1C and promoted the proliferation of cumulus cells. Therefore, 50ng/mlBMP15 was added to investigate the effect of JMJD1C on apoptosis and proliferation of cumulus cells mediated by BMP15. Based on the above results, the expression of JMJD1C gene was reduced by siRNA knockout, and the changes of Bcl2 and Bax expression levels of apoptotic marker genes Bcl2 and Bax were detected at the level of mRNA and protein at the same time. The results of real-time fluorescence quantitative PCR and Western Blot showed that the ratio of Bcl2 to Bax was significantly increased after BMP15 was added to silencing the JMJD1C gene, that is, the apoptotic rate of cumulus cells was decreased. The results indicated that the indirect connection between BMP15 and JMJD1C could affect the apoptosis of cumulus cells, and JMJD1C could inhibit the anti-apoptotic effect of BMP15 in cumulus cells. In conclusion, JMJD1C in bovine cumulus cells did not directly regulate the demethylation of histone H3K9me1H3K9me2 at the mRNA level, while JMJD1C could affect the anti-apoptosis effect of BMP15 in bovine cumulus cells. The results are helpful to recognize the differences between proteins closely related to KDM3, and to explore the function of JMJD1C and provide a basis for revealing the molecular mechanism of cumulus cell apoptosis.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S823

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本文編號：2332280