【摘要】：禽呼腸孤病毒(Avian reovirus, ARV)感染可以引起的雞和火雞的以關(guān)節(jié)炎、鍵鞘炎、吸收障礙為特征的免疫抑制病。該病可導(dǎo)致雞的死亡率增加、病雞增重減少、飼料轉(zhuǎn)化率下降、產(chǎn)蛋下降、孵化率/受精率降低,給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)外的研究表明目前使用的弱毒疫苗S1133仍可能具有一定的致病性,因此研制安全、有效的新型疫苗對ARV感染的防控具有重要意義。本研究采用RT-PCR擴(kuò)增ARV GX/2010/1株的σB、σC基因,定向克隆至pEASY-M1表達(dá)載體中；再分別將σB、σC基因的表達(dá)盒與含有馬立克氏病毒(MDV) CVI988疫苗毒株sorfl/sorf2序列pU/D載體相連,構(gòu)建含σB、σC基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pU/D-aB和pU/D-aC。分別將pU/D-aB和pU/D-aC與含有GFP報告基因的MDV CVI988基因組DNA以磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞,通過篩選、純化獲得重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-aC。經(jīng)PCR、Western blot和IFA分析,σB、σC基因分別正確插入到MDV CVI988毒株基因組中,并可以成功表達(dá)ARV σB蛋白和σC蛋白。本研究評價了1日齡SPF雞接種重組病毒r-MDV-σB和r-MDV-aC后對ARV GX/2010/1株及MDV RB1B超強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)效力。將70只1日齡SPF雞隨機(jī)分成5組：rMDV-σB免疫組、rMDV-aC免疫組、S1133疫苗免疫組、非免疫攻毒對照組和健康對照組,從發(fā)病率、死亡率、臨床癥狀、病理組織學(xué)變化、對增重的影響和抗體水平等方面評價免疫效力。前兩組的試驗雞1日齡時分別頸部皮下接種5000空斑形成單位(PFU)的r-MDV-aB和r-MDV-aC,第三組于7日齡接種1羽份的S1133疫苗；21日齡時,前四組試驗雞均用104.0EID50/雞的ARV GX/2010/1毒株攻擊,攻毒第14天進(jìn)行剖殺。結(jié)果顯示rMDV-σB免疫組和rMDV-σC免疫組在ARV攻毒后的發(fā)病率分別為40%和26.7%與非免疫攻毒對照組發(fā)病率100%存在顯著差異(p0.05)；攻毒前后(21日齡～35日齡)各免疫組增重差異不顯著(p0.05),但S1133疫苗組和rMDV-σB免疫組增重小于rMDV-σC免疫組。經(jīng)臨床檢查,攻毒后rMDV-σC免疫組的脾臟病變較S1133疫苗免疫組和rMDV-σB免疫組輕微。本研究還評價了r-MDV-σB和r-MDV-σC分別對MDV RB1B超強(qiáng)毒株攻擊的免疫保護(hù)效果。將80只1日齡SPF雞隨機(jī)分為4個試驗組：rMDV-σB免疫組、rMDV-σC免疫組、CVI988/Rispens免疫組和攻毒對照組,每組20只試驗雞；rMDV-σB免疫組、rMDV-aC免疫組和CVI988/Rispens免疫組的試驗雞分別于1日齡時頸部皮下接種5000 PFU/雞的相應(yīng)疫苗；7日齡時,所有試驗雞經(jīng)腹腔接種500 PFU/雞的MDV RB1B超強(qiáng)毒株。連續(xù)觀察90天,記錄各試驗組雞的發(fā)病和死亡情況。rMDV-aB免疫組和rMDV-aC免疫組對MDVRBlB強(qiáng)毒株攻擊能夠提供完全保護(hù),與MDV CVI988/Rispens免疫組的效果相當(dāng)。綜上所述,本研究構(gòu)建的重組病毒rMDV-aC是較理想的新型疫苗候選毒株。
[Abstract]:Avian reovirus (Avian reovirus, ARV) infection may cause immunosuppressive diseases in chickens and turkeys characterized by arthritis, ketovitis, and dysabsorption. The disease could increase the mortality of chickens, decrease the weight gain, feed conversion rate, egg laying rate, hatching rate and fertilization rate, and bring great economic losses to the poultry industry. Studies at home and abroad show that the attenuated vaccine S1133 used at present may still have some pathogenicity, so it is of great significance to develop a safe and effective new vaccine for the prevention and control of ARV infection. In this study, the 蟽 B, 蟽 C genes of ARV GX/2010/1 strain were amplified by RT-PCR and cloned into pEASY-M1 expression vector. Then, the expression cassette of 蟽 B and 蟽 C gene was linked to the pU/D vector containing sorfl/sorf2 sequence of Marek's virus (MDV) CVI988 vaccine strain, respectively. The transfer vector pU/D-aB and pU/D-aC. containing 蟽 B and 蟽 C genes were constructed. The recombinant viruses r-MDV- 蟽 B and r-MDV-aCwere purified by co-transfection of pU/D-aB and pU/D-aC with MDV CVI988 genomic DNA containing GFP reporter gene by calcium phosphate precipitation. By PCR,Western blot and IFA analysis, 蟽 B and 蟽 C genes were inserted into the genome of MDV CVI988 strain correctly, and ARV 蟽 B protein and 蟽 C protein were successfully expressed. In this study, the immunological protective effects of 1 day old SPF chickens inoculated with recombinant virus r-MDV- 蟽 B and r-MDV-aC on ARV GX/2010/1 strain and MDV RB1B supervirulent strain were evaluated. Seventy 1-day-old SPF chickens were randomly divided into five groups: rMDV- 蟽 B immunized group, rMDV-aC immunized group, S1133 vaccine immunized group, non-immunized control group and healthy control group. The effect on weight gain and antibody level were evaluated. The first two groups were inoculated subcutaneously with r-MDV-aB and r-MDV-aCof 5000 plaque forming unit (PFU) in the neck of the first two groups, and the third group were inoculated with S1133 vaccine of 1 feather at 7 days of age. At the age of 21 days, the first four groups of chickens were all attacked with ARV GX/2010/1 strain of 104.0EID50/ chickens and killed on the 14th day of attack. The results showed that the incidence of rMDV- 蟽 B immunized group and rMDV- 蟽 C immunization group were 40% and 26.7% after ARV attack, respectively, compared with 100% of non-immunized control group (p0.05). There was no significant difference in weight gain between the two groups (p0.05), but the weight gain of S1133 vaccine group and rMDV- 蟽 B immunization group was lower than that of rMDV- 蟽 C immunization group. By clinical examination, the spleen lesion of rMDV- 蟽 C immunized group was less than that of S1133 vaccine and rMDV- 蟽 B immunization group. The immune protection of r-MDV- 蟽 B and r-MDV- 蟽 C against MDV RB1B strain was also evaluated. 80 1-day-old SPF chickens were randomly divided into four groups: rMDV- 蟽 B immunized group, rMDV- 蟽 C immunization group, CVI988/Rispens immunization group and control group. RMDV- 蟽 B immunized chickens, rMDV-aC immunized chickens and CVI988/Rispens immunized chickens were subcutaneously inoculated with 5000 PFU/ chickens at 1 day of age, and at 7 days old, all the tested chickens were intraperitoneally inoculated with MDV RB1B supervirulent strains of 500 PFU/ chickens. After 90 days of continuous observation, the incidence and death of chickens in each test group were recorded. RMDV-aB immunization group and rMDV-aC immunization group could provide complete protection against MDVRBlB virulent strain attack, which was similar to that of MDV CVI988/Rispens immunization group. In conclusion, the recombinant virus rMDV-aC constructed in this study is an ideal new vaccine candidate strain.
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2332247