【摘要】：鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白是病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白,組成病毒的衣殼,在宿主免疫應(yīng)答中起著重要作用,為探究其與宿主蛋白之間的相互作用,以期了解該蛋白在病毒入侵機體過程中發(fā)揮的功能。本論文以鴨圓環(huán)病毒Cap蛋白為誘餌,從感染鴨圓環(huán)病毒的鴨脾臟的酵母雙雜交cDNA文庫中篩選與其有相作的宿主蛋白質(zhì),為進一步研究其在入侵宿主中的作用奠定基礎(chǔ)。1.Cap蛋白多克隆抗體的制備將Cap基因優(yōu)化的密碼子1-108 bp片段與未優(yōu)化109-774 bp的片段進行融合PCR后,連接至PGM-T載體,再亞克隆至原核表達載體pET-32a(+)中,得到重組表達質(zhì)粒PET32-CapY108,經(jīng)菌落PCR,酶切和測序鑒定后,重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達菌Rosetta,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE分析表達情況。利用Ni-NTA柱親和層析純化蛋白,測定蛋白濃度,SDS-PAGE分析蛋白純化效果,利用感染DuCV鴨的陽性血清Western blot檢測純化蛋白,并進一步將純化的蛋白免疫新西蘭家兔,制備多克隆抗體。結(jié)果表明：成功融合擴增出774 bp的CapY108基因片段,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32-CapY108,經(jīng)菌落PCR、酶切和測序鑒定正確后,導(dǎo)入Rosetta菌中,重組Cap蛋白以包涵體的表達形式存在,大小約為50 KD,與預(yù)期大小一致。純化后的重組蛋白條帶較清晰,濃度約為0.289 mg/mL, Western blot檢測表明,表達蛋白為Cap蛋白,并且成功純化。進一步將純化的Cap蛋白免疫新西蘭家兔后,ELISA檢測抗體效價1：80000以上,Western blot利用制備多克隆抗體檢測出Cap蛋白條帶,成功制備出其多克隆抗體,為后續(xù)研究提供了試驗素材。2.酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建將密碼子優(yōu)化后的Cap基因構(gòu)建至酵母雙雜交質(zhì)粒pGBKT7中,構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-Cap,菌落PCR及酶切鑒定正確后,轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold感受態(tài),利用Western blot檢測誘餌蛋白是否表達,同時檢測誘餌蛋白對酵母細胞有無毒性以及是否有自激活現(xiàn)象。結(jié)果表明,成功構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-Cap,質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母細胞后能夠表達,大小50 KD左右,同時誘餌蛋白對其無毒性,且沒有自激活現(xiàn)象。為下一步利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與其有相互作用的蛋白奠定了基礎(chǔ)。3.酵母雙雜交文庫的構(gòu)建提取感染DuCV后鴨脾臟的總RNA,將RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,經(jīng)LD-PCR擴增得到雙鏈cDNA,純化后,與pGADT7-Rec載體共同轉(zhuǎn)化至酵母菌Y187中,涂至SD/-Leu平板,5d后收菌,檢測文庫質(zhì)量。結(jié)果表明：構(gòu)建cDNA文庫滴度為1.6×107cfu/mL,轉(zhuǎn)化效率為1.29×106/4.64μg,擴增后文庫滴度為3.7×108cfu/mL,隨機挑取22個克隆質(zhì)粒,PCR鑒定顯示,其插入片段長度在500-3500 bp,隨機挑取15個克隆質(zhì)粒測序鑒定,重組率為93.3%。結(jié)果表明,該文庫構(gòu)建成功,可進一步利用其篩選與Cap蛋白相關(guān)的宿主蛋白。4.與Cap蛋白互作蛋白的篩選為篩選與Cap蛋白有相互作用的宿主蛋白,利用酵母雙雜交Cap誘餌與感染DuCV后鴨脾臟的cDNA文庫雜交,涂至TDO平板,3 d后挑取大的白色菌落,劃線至QDO/X/A,傳代3次,以期篩選出互作蛋白,并進一步從篩選的陽性酵母菌中提取質(zhì)粒,測序鑒定,挑取未移碼的文庫質(zhì)粒與pGBKT7-Cap質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)至酵母菌Y2HGold,涂至平板QDO/X/A,進一步驗證其相互作用。實驗結(jié)果顯示：成功篩選出一個未移碼的全長鴨mRNA,精脒/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1, SAT1),經(jīng)共轉(zhuǎn)染酵母菌Y2HGold驗證,表明該基因表達的蛋白能與Cap蛋白相互作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2319956