【摘要】：多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, Pm)是巴氏桿菌屬最重要的致病菌,屬于革蘭氏陰性菌,能夠感染家養(yǎng)和野生動(dòng)物,具有廣泛的宿主譜。多殺性巴氏桿菌根據(jù)莢膜血清型的不同分為A、B、D、E和F 5種血清群,根據(jù)LPS抗原性的不同又可將其分為16種血清型。近年來,綜合國內(nèi)外報(bào)道我們發(fā)現(xiàn)引起肉牛多殺性巴氏桿菌病的主要血清型是A型和B型,而且A型多殺性巴氏桿菌疾病呈逐年上升趨勢。目前,預(yù)防牛源巴氏桿菌病的疫苗主要是針對(duì)B型多殺性巴氏桿菌的滅活疫苗,雖然該類疫苗在控制牛源巴氏桿菌病中起到了重要的作用,但是對(duì)不同血清型的交叉保護(hù)性弱。因此,需要開發(fā)一種安全有效,并能提供交又保護(hù)性的新型疫苗來預(yù)防多殺性巴氏桿菌疾病,而牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的篩選,為該新型融合疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。目前相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),ompA、ompH、PlpE、pm0979、P6以及pfhB 6種抗原能對(duì)單一血清型提供一定的保護(hù)率,而且,在多種血清型中保守性極高。但是,在這些成分中哪些能提供交叉保護(hù)性作用還是未知。因此,本研究以這6種抗原基因作為研究對(duì)象,在相同免疫劑量與攻毒劑量的前提下,進(jìn)行了如下研究：1、牛源多殺性巴氏桿菌交叉保護(hù)性抗原的初步篩選以牛源A型Pm CQ2株基因組為模板,利用PCR技術(shù)對(duì)6種保護(hù)性抗原基因進(jìn)行擴(kuò)增,構(gòu)建相應(yīng)的原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21進(jìn)行表達(dá),同時(shí)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化以及Western blot鑒定。用純化后的蛋白皮下免疫小鼠,于免21 d后,用ELISA法檢測小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況,并用2 LD50 Pm CQ2株(4.4× 105cfu)、Pm B型(2.96×104cfu)腹腔攻毒,計(jì)算小鼠存活率。結(jié)果顯示,rPM0979、rPLPE以及rOMPH三種蛋白對(duì)A型和B型多殺性巴氏桿菌均提供了良好的保護(hù)性,其中對(duì)Pm A型保護(hù)率分別為40%、70%、60%,對(duì)Pm B型保護(hù)率分別為30%、40%、30%。結(jié)果提示,蛋白rPM0979、rPLPE以及rOMPH具有交叉保護(hù)性,可作為后續(xù)研制融合疫苗的潛在蛋白。2、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-ompH融合基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的交叉保護(hù)性研究通過生物信息學(xué)分析獲得pm0979、ompH基因的主要抗原表位片段,并將兩個(gè)基因片段用3種不同長度的疏水性linker進(jìn)行拼接融合(標(biāo)記為pm0979-L6-ompH、 pm0979-L10-ompH、pm0979-L15-ompH)。對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá),并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化及Western blot分析,最終以rPM0979、rOMPH、rPM0979-L6-OMPH、 rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH蛋白免疫小鼠后進(jìn)行Pm CQ2株、PmB型攻毒試驗(yàn),分別測定小鼠體內(nèi)抗體產(chǎn)生情況以及對(duì)小鼠的交叉保護(hù)性效果。結(jié)果顯示,表位基因表達(dá)的單一蛋白的交叉保護(hù)性與之前的全長基因表達(dá)的蛋白相比較,其交叉保護(hù)性有所降低,但融合蛋白的相對(duì)來說都有所提高；其中,融合蛋白rPM0979-L6-OMPH對(duì)Pm CQ2株攻毒的小鼠保護(hù)率為60%,對(duì)Pm B型攻毒小鼠保護(hù)率為20%,融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH對(duì)Pm A型攻毒的小鼠保護(hù)率為70%,對(duì)Pm B型攻毒小鼠保護(hù)率為30%。結(jié)果提示,3種rPM0979-OMPH融合蛋白對(duì)小鼠具有良好的交叉保護(hù)性,其中融合蛋白rPM0979-L10-OMPH、rPM0979-L15-OMPH交叉保護(hù)性效果較好；同時(shí)該結(jié)果還提示,不同linker長度的融合蛋白對(duì)小鼠的保護(hù)率不同,而且linker的最佳長度為10aa。3、牛源多殺性巴氏桿菌pm0979-PlpE融合基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的交叉保護(hù)性研究通過生物信息學(xué)分析獲得了pm0979、PlpE基因的主要抗原表位,將pm0979、PlpE基因通過長度為1Oaa的linker相連,構(gòu)建融合基因pm0979-L10-PlpE。對(duì)融合基因進(jìn)行表達(dá),并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化及Western blot分析。通過小鼠試驗(yàn)評(píng)價(jià)重組蛋白rPM0979-L10-PLPE的交叉保護(hù)性。結(jié)果表明,融合蛋白rPM0979-L10-PLPE對(duì) Pm A型攻毒小鼠的保護(hù)率為80%,對(duì)Pm B型攻毒小鼠的保護(hù)率為40%。結(jié)果提示,融合蛋白rPM0979-L10-PLPE具有很好的交叉保護(hù)性。
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【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃園媛;牛源A型多殺性巴氏桿菌plpE基因的克隆表達(dá)及DNA疫苗的研究[D];西南大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：2319845