【摘要】：新生仔豬腹瀉一直以來是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病,雖然引起仔豬腹瀉的原因比較復雜,但致病性大腸桿菌是引起仔豬腹瀉的重要病原菌。目前對大腸桿菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的分離鑒定、免疫血清學檢測以及傳統(tǒng)的PCR方法等,但這些方法不能滿足基層現(xiàn)場快速檢測的要求。環(huán)介導等溫擴增技術是Notomi等開發(fā)的一種新型的核酸擴增技術,由于該技術具有操作簡單、快速便捷、特異型強、靈敏度高、成本低等特點,已經在病原微生物的檢測中廣泛應用。因此,該研究為滿足臨床的快速檢測,建立了用于仔豬源致病性大腸桿菌檢測及毒力分析的LAMP技術。本研究根據(jù)GenBank公布的大腸桿菌腸毒素(LT1、ST1、ST2)基因、菌毛(K88、K99、987P)基因、毒力島(HPI、ETT2、LEE)基因序列中的保守序列,運用在線引物設計軟件(http://primerexplorer.jp/e/)分別設計一套LAMP引物。并對各反應體系中的Mg2+濃度、甜菜堿濃度、dNTP濃度、內引物濃度、BstDNA聚合酶添加量以及反應溫度和反應時間進行了摸索,分別建立了檢測腸毒素基因型、菌毛基因型和毒力島基因型大腸桿菌的LAMP方法。本研究分別以腸毒素(LT1、ST1、ST2)基因型、菌毛(K88、K99、987P)基因型、毒力島(HPI、ETT2、LEE)基因型大腸桿菌為陽性,以沙門菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、變形桿菌、產氣莢膜梭菌、豬丹毒桿菌等8株常見細菌為陰性對照,以超純水為空白對照,分別對建立的LAMP方法進行了特異性實驗,結果顯示,只有陽性菌為陽性結果,其它菌株均顯陰性未發(fā)生交叉反應。此外,為驗證本研究建立的LAMP方法的靈敏性,以常規(guī)PCR方法為對照,分別對本研究建立的LAMP方法的靈敏性進行了評價,結果顯示,本研究建立的LAMP方法與傳統(tǒng)的PCR方法的陽性檢出率均一致,但靈敏性顯著高于常規(guī)PCR方法。本研究還采用常規(guī)PCR方法和LAMP方法對采集的117份新生仔豬腹瀉病料進行檢測,結果表明,從42份病料(35.90%)中檢測到ETEC,66份病料(56.41%)中檢測到HPI+大腸桿菌,18份病料(15.38%)中檢測到LEE+大腸桿菌,117份病料(100%)中均檢測到ETT2+大腸桿菌,其中有19份病料(16.24%)為HPI+大腸桿菌和ETEC混合感染,18份病料(15.38%)為LEE+大腸桿菌和ETEC混合感染,42份病料(35.89%)為ETT2+大腸桿菌和ETEC混合感染,10份病料(8.55%)為HPI+、ETT2+大腸桿菌和ETEC混合感染,9份(7.69%)為LEE+、ETT2+腸桿菌和ETEC混合感染,9份(7.69%)為HPI+、LEE+、ETT2+大腸桿菌和ETEC混合感染。
[Abstract]:Diarrhea of newborn piglets has always been an important disease in pig industry. Although the causes of diarrhea in piglets are complicated, pathogenic Escherichia coli is an important pathogen causing diarrhea in piglets. At present, the detection methods of Escherichia coli mainly include traditional isolation and identification, immune serological detection and traditional PCR method, but these methods can not meet the requirements of rapid detection at the grass-roots level. Loop mediated isothermal amplification is a new nucleic acid amplification technique developed by Notomi et al. Because of its advantages of simple operation, fast and convenient operation, high sensitivity, low cost and so on. It has been widely used in the detection of pathogenic microorganisms. Therefore, in order to satisfy the rapid clinical detection, a LAMP technique was developed for the detection and virulence analysis of pathogenic Escherichia coli from piglets. This study was based on the conserved sequence of Escherichia coli enterotoxin (LT1,ST1,ST2) gene, fimbriae gene (K88N K99987P) and virulence island (HPI,ETT2,LEE) gene published by GenBank. A set of LAMP primers were designed by using online primer design software (http://primerexplorer.jp/e/). Mg2 concentration, betaine concentration, dNTP concentration, internal primer concentration, BstDNA polymerase addition amount, reaction temperature and reaction time in each reaction system were explored. The LAMP method of Escherichia coli for fimbriae and virulence island genotypes. In this study, enterotoxin (LT1,ST1,ST2) genotypes, pili genotypes (K88N K99987P), virulence island (HPI,ETT2,LEE) genotypes, Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus, Riemer's Duck, Pasteurella spp. Eight common bacteria such as Streptococcus sp., Proteus mutans, Clostridium perfringens, erysipelas were used as negative control, and ultrapure water as blank control. The results showed that, Only positive bacteria were positive, and no cross reaction was found in all other strains. In addition, in order to verify the sensitivity of the LAMP method established in this study, the sensitivity of the LAMP method established in this study was evaluated by comparing with the conventional PCR method. The positive rate of the LAMP method was consistent with that of the traditional PCR method, but the sensitivity was significantly higher than that of the conventional PCR method. Routine PCR and LAMP methods were also used to detect the diarrhea disease materials of 117 newborn piglets. The results showed that HPI Escherichia coli was detected from 42 samples (35.90%) of ETEC,66 samples (56.41%). LEE Escherichia coli was detected in 18 samples (15.38%) and ETT2 Escherichia coli was detected in 117 samples (100%). Among them, 19 samples (16.24%) were mixed with HPI Escherichia coli and ETEC. 18 samples (15.38%) were mixed with LEE Escherichia coli and ETEC, 42 samples (35.89%) were ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection, 10 samples (8.55%) were HPI, ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection. 9 (7.69%) were LEE, Enterobacter ETT2 and ETEC mixed infection, and 9 (7.69%) were HPI, LEE, ETT2 Escherichia coli and ETEC mixed infection.
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S852.61

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本文編號：2308284