【摘要】：1.肉雞感染鼻氣管鳥桿菌的分離與鑒定從江蘇省某白羽肉雞場出現(xiàn)呼吸道癥狀的雞群中分離獲得3株病原菌,在綿羊血瓊脂上劃線,37℃,5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后可見灰白色、表面隆起、邊緣整齊、圓形有丁酸樣氣味的菌落,而在麥康凱瓊脂上不生長。經革蘭氏染色后,在顯微鏡下可觀察到粉紅色、短小桿菌(長0.6～1.5μm,寬0.2～0.6μm),單個或呈短絲狀排列呈多形性。經負染通過電鏡觀察未發(fā)現(xiàn)有莢膜、鞭毛、菌毛等細菌的特殊結構。用API20NE生化反應試劑盒檢測其結果顯示,硝酸鹽反應、吲哚試驗為陰性,葡萄糖、氧化酶、β-半乳糖苷酶、脲酶均為陽性。根據(jù)GenBank已發(fā)表的鼻氣管鳥桿菌(Omithobacterium rhinotracheale,ORT)16SrRNA基因序列進行多重比對后設計出一對特異引物,經PCR擴增出 379bp條帶。經測序后其基因序列與GenBank已發(fā)表的ORT基因序列進行比較結果顯示,同源性均在99.4%以上,表明該擴增片段為鼻氣管鳥桿菌的特異片段。2.鼻氣管鳥桿菌OMA87蛋白原核表達及抗原性鑒定通過參考 GenBank 中 ORT-DSM 15997 株基因序列(GenBank:CP003283.1),設計了覆蓋全部ORTOMA87編碼區(qū)(第32322至第34886位堿基)的特異性引物,使用PCR方法將其擴增并插入pMD 18-T Vector中進行克隆。測序正確后,用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ對重組質粒進行雙酶切,并分別將目的片段連接入原核表達載體pGEX-6p-1,提取質粒pGEX-6p-1-OMA87,將質粒轉化進大腸桿菌BL21(DE3)中,IPTG誘導表達。分析發(fā)現(xiàn),融合蛋白GST-OMA87(121KD)在上清和沉淀中均有表達。將上清中的蛋白純化、濃縮后,用ORT陽性SPF雞血清作為一抗,兔抗雞IgG作為二抗進行Western-blot驗證,結果顯示融合蛋白GST-OMA87可與SPF雞ORT陽性血清發(fā)生反應,具有較好的抗原性,說明此融合蛋白可用作制備針對ORT單克隆抗體。3.鼻氣管鳥桿菌OMA87蛋白的單克隆抗體制備利用研究二所得純化的重組蛋白GST-OMA87作為免疫原,按照常規(guī)程序免疫6～8周齡Balb/c小鼠后,取其脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行融合,通過間接ELISA篩選陽性細胞株,最終獲得兩株穩(wěn)定分泌抗重組蛋白OMA87的單克隆抗體細胞株:ORT-OMA87-2C4和ORT-OMA87-5G9;抗體亞類鑒定2C4抗體重鏈IgG2a,5G9抗體重鏈為IgG1,輕鏈均為Kappa型;其腹水抗體效價分別為1:32000、1:64000。經間接ELISA特異性檢測結果顯示2C4、5G9均能與ORT包被抗原呈陽性反應,且與包被其它幾種抗原之間無交叉反應。利用單抗檢測分離鑒定的ORT陽性菌株,為進一步建立特異性強、敏感度高、簡便快捷的檢測方法奠定了基礎。
[Abstract]:1. Isolation and identification of avian bacillus rhinotrachea infection in broilers, three strains of pathogenic bacteria were isolated from chickens with respiratory symptoms in a white broiler farm in Jiangsu Province. The strains were underlined in sheep blood Agar. Grayish white was observed in 37 鈩，

本文編號：2284490