【摘要】：豬流感是由豬流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病,病毒的基因組為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA,這一特點(diǎn)使病毒能通過基因突變和基因重配不斷進(jìn)化,從而逃避宿主的免疫壓力。探究機(jī)體感染豬流感病毒后的天然免疫變化和宿主蛋白的抗病毒作用具有重要的理論意義。1.豬流感病毒感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞天然免疫信號通路的影響從35日齡健康仔豬肺部分離肺泡巨噬細(xì)胞,以MOI=5感染H3N2豬流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005,間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)豬流感病毒能夠在豬原代肺泡巨噬細(xì)胞中增殖。熒光定量RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA在感染后6-24h均出現(xiàn)顯著升高(p0.05);IRF-7、IFN-β的mRNA在感染后8-24h顯著升高(p0.05);MyD88和MAVS mRNA在感染后8h升高,12h后又開始緩慢下降。放射性免疫方法檢測上清中細(xì)胞因子的含量,其中IL-1β、TNF-α分別在感染后6h和8h出現(xiàn)峰值;IFN-α及IFN-β在病毒感染6-8h后顯著升高,至24h時仍維持較高水平(p0.05)。結(jié)果表明,該豬流感病毒毒株能夠在豬肺泡巨噬細(xì)胞中有效增殖,且能激活TLR及RLR信號通路中相關(guān)受體及效應(yīng)因子的基因與蛋白表達(dá)。2.豬流感病毒感染對上皮細(xì)胞系A(chǔ)549天然免疫信號通路的影響人肺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549以MOI=5感染H3N2豬流感病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬流感病毒能夠在A549細(xì)胞上有效增殖,感染后48h,毒價可達(dá)106.1TCID50/mL。熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,TLR-3、TLR-7、RIG-Ⅰ、MDA-5的mRNA水平在感染后6h均開始顯著升高(p0.05)。IRF-7、IFN-α及IFN-βmRNA在感染后8-24h顯著升高(p0.05)。MyD88和MAVS mRNA在8h時升高,12h后又開始緩慢下降,至24h時與對照組無顯著差異(p0.05)。Western blot分析發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ、TLR-3、TLR-7等蛋白表達(dá)水平在病毒感染后升高,而MAVS在感染后降低。此外,雙熒光素酶報告試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)polyⅠ:C刺激或SIV感染后,能顯著誘導(dǎo)IFN-β啟動子、IRF3/7結(jié)合位點(diǎn)、NF-κB結(jié)合位點(diǎn)報告質(zhì)粒的熒光素酶表達(dá)。結(jié)果表明,該豬流感病毒毒株能夠在A549細(xì)胞中增殖,且能夠有效激活TLR及RLR介導(dǎo)的天然免疫信號通路。A549細(xì)胞系可以作為研究豬流感病毒感染后宿主細(xì)胞天然免疫變化的體外細(xì)胞模型。3.MAVS通過介導(dǎo)IFN-Ⅰ的產(chǎn)生抑制豬流感病毒的增殖在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建各種MAVS截?cái)嗤蛔冑|(zhì)粒,通過過表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAVS能顯著激活I(lǐng)FN-β啟動子活性,進(jìn)而抑制病毒的增殖,且呈劑量依賴性。當(dāng)缺失CARD結(jié)構(gòu)或者跨膜區(qū)時,MAVS幾乎不能誘導(dǎo)IFN-β啟動子或NF-κB、IRF-3/7結(jié)合位點(diǎn)的活化,且對病毒滴度幾乎無抑制效果;缺失脯氨酸富集區(qū)的突變質(zhì)粒對其功能的影響不顯著,但其活性低于完整的MAVS(p0.05)。表明CARD結(jié)構(gòu)或跨膜區(qū)對MAVS介導(dǎo)的IFN-I的產(chǎn)生至關(guān)重要。通過人工合成的siRNA序列抑制A549細(xì)胞的內(nèi)源性MAVS表達(dá),再次感染豬流感病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的IFN-β啟動子的活化受到顯著抑制,病毒滴度顯著升高(p0.05),表明MAVS對宿主細(xì)胞IFN-Ⅰ抗病毒通路的活化是必需的,提示線粒體可能在宿主的天然免疫通路中發(fā)揮重要作用。4.MAVS介導(dǎo)病毒引起的細(xì)胞凋亡在pCMV-Flag-MAT-TAG-MAVS質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建各種MAVS截?cái)嗤蛔冑|(zhì)粒，，通過過表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MAVS能顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡,且呈劑量依賴性(p0.05)。Western blot檢測發(fā)現(xiàn),在MAVS過表達(dá)細(xì)胞中,Caspase-9、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著升高(p0.05)。缺失CARD結(jié)構(gòu)或跨膜區(qū)時,凋亡比率顯著降低(p0.05),而缺失脯氨酸富集區(qū)對細(xì)胞凋亡的影響不顯著(p0.05)。通過特異性siRNA抑制細(xì)胞內(nèi)源性MAVS的表達(dá)后,再次感染豬流感病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染引起的細(xì)胞凋亡比率顯著下降(p0.05),表明MAVS對豬流感病毒感染導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的發(fā)生是必不可少的。通過Transwell小室試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染MAVS能引起凋亡細(xì)胞比例顯著升高,而處于同樣培養(yǎng)環(huán)境的對照轉(zhuǎn)染細(xì)胞未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,表明MAVS介導(dǎo)的凋亡不是IFN-Ⅰ的副效應(yīng),與IFN-Ⅰ的產(chǎn)生是獨(dú)立發(fā)揮作用的。研究提示,MAVS介導(dǎo)的凋亡途徑在宿主抗病毒感染中可能發(fā)揮著重要的作用。5.豬流感病毒相關(guān)蛋白對MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生及凋亡的影響將豬流感病毒A/Swine/Shandong/3/2005(H3N2)的NS1、PB1-F2及NP表達(dá)質(zhì)粒,分別與MAVS全長表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)NS1、PB1-F2能顯著降低MAVS誘導(dǎo)的IFN-β啟動子活性(p0.05),且NS1抑制MAVS介導(dǎo)的IFN-β啟動子的活性呈劑量依賴性;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示NS1蛋白能顯著拮抗MAVS介導(dǎo)的凋亡的產(chǎn)生,并呈顯著的劑量依賴性(p0.05),而PB1-F2、NP蛋白對MAVS介導(dǎo)的凋亡的抑制作用不顯著(p0.05);MAVS過表達(dá)能顯著抑制病毒的增殖,共表達(dá)NS1質(zhì)粒后,病毒滴度顯著升高(p0.05);共表達(dá)PB1-F2、NP質(zhì)粒也能引起病毒滴度的升高,但差異不顯著(p0.05)。研究結(jié)果表明,NS1能夠拮抗MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡,為深入認(rèn)識豬流感病毒逃避宿主細(xì)胞天然免疫監(jiān)視的機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。綜上可見,豬流感病毒感染能有效激活宿主細(xì)胞TLR及RLR介導(dǎo)的天然免疫信號通路,且RLR通路中的關(guān)鍵接頭蛋白MAVS在IFN-Ⅰ產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。同時,豬流感病毒的NS1蛋白能顯著拮抗MAVS介導(dǎo)的IFN-Ⅰ及凋亡的產(chǎn)生。這為深入研究宿主識別和清除病毒感染及病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制提供了新的思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28

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本文編號：2259477