發(fā)布時(shí)間：2018-09-14 20:37

【摘要】：本研究通過(guò)原核表達(dá),重組牛脂多糖結(jié)合蛋白(recombinant bovine lipopolysaccharide binding protein,rbLBP)和點(diǎn)突變脂多糖結(jié)合蛋白(rbM-LBP)。在乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)基礎(chǔ)上,利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞,建立了乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型。同時(shí)采用基因芯片技術(shù)對(duì)炎癥反應(yīng)模型差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,探討了LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子及信號(hào)通路。并進(jìn)一步通過(guò)不同濃度的rbLBP及不同的LBP作用于炎癥反應(yīng)模型,探討LBP影響炎癥反應(yīng)的作用及其分子機(jī)制,為L(zhǎng)BP的應(yīng)用及防治牛乳腺炎提供一定的參考依據(jù)。1LBP載體制備、重組蛋白表達(dá)與純化根據(jù)已知牛LBP基因序列及LBP第二外顯子發(fā)生點(diǎn)突變的基因序列構(gòu)建目的基因,并建立目的基因載體質(zhì)粒pET22b,通過(guò)BL21大腸桿菌細(xì)胞為宿主的表達(dá)系統(tǒng),IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后純化,得到高純度的重組牛LBP蛋白和rbM-LBP蛋白,去除內(nèi)毒素,通過(guò)免疫印跡分析鑒定重組蛋白。結(jié)果表明,本試驗(yàn)成功構(gòu)建了載體質(zhì)粒pET22b(+)-LBP和pET22b(+)-rbM-LBP,通過(guò)BL21大腸桿菌細(xì)胞表達(dá)和純化,得到高純度的rbLBP蛋白和rbM-LBP蛋白。2奶牛乳腺上皮細(xì)胞的優(yōu)化培養(yǎng)及其炎癥反應(yīng)模型的建立選擇健康中國(guó)荷斯坦牛,無(wú)菌采集乳腺組織,采用組織塊接種法在DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)牛乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞純化后分別用β-酪蛋白和角蛋白鑒定,結(jié)果表明,奶牛乳腺上皮細(xì)胞純度在95%以上,符合試驗(yàn)要求。LPS作用于牛乳腺上皮細(xì)胞12h,10、20、100μg/mL濃度的LPS處理組IL-1β、TNF-α表達(dá)及分泌均顯著上升,濃度在1～10Oμg/mL范圍內(nèi)LPS作用有劑量依賴性,100μg/mL LPS處理組可能因細(xì)胞毒性的作用,IL-1β、TNF-α的表達(dá)有略微下降,但仍然顯著高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)果表明,LPS濃度10μg/mL時(shí)顯著提高IL-1β、TNF-α的表達(dá)及釋放(P0.05),并致細(xì)胞早期凋亡發(fā)生。以上表明,本試驗(yàn)成功建立了奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)體系及炎癥反應(yīng)模型。3 LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型基因表達(dá)譜分析為了進(jìn)一步探討和了解乳腺感染后的免疫反應(yīng),在LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞建立炎癥反應(yīng)模型的基礎(chǔ)上。進(jìn)一步通過(guò)表達(dá)譜基因芯片分析,從超過(guò)43000個(gè)記錄中篩選了958個(gè)顯著差異表達(dá)基因,其中LPS誘導(dǎo)后472個(gè)基因上調(diào),486個(gè)基因下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析,篩選參與防御、免疫、炎癥反應(yīng)的基因,KEGG分析發(fā)現(xiàn)Toll樣受體途徑和趨化因子途徑響應(yīng)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)過(guò)程。定量PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果,發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88、NFKB、IL-1β、NOS2和TNF-α上調(diào)表達(dá),并參與TLR4的信號(hào)通路,LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞TLR4和NF-kB蛋白表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明在LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活,LPS可致上皮細(xì)胞炎性損傷。4重組牛脂多糖結(jié)合蛋白(rbLBP)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的影響本試驗(yàn)通過(guò)不同濃度的重組牛脂多糖結(jié)合蛋白(rbLBP)作用于LPS誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,不同濃度(10和20μg/mL)的重組牛脂多糖結(jié)合蛋白(rbLBP)對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性,并可能會(huì)n弱LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎性損傷;下調(diào)toll樣受體4(TLR4)、核因子kB(NF-kB)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá);減少IL-1β、TNF-α的分泌;下調(diào)TLR4和NF-kB(P65)的蛋白表達(dá);核轉(zhuǎn)錄因子κB活性也被減弱。這些結(jié)果表明,高濃度的rbLBP減弱LPS誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥損傷作用,至少部分是通過(guò)減少促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)的;rbLBP被發(fā)現(xiàn)直接抑制LPS/TLR4介導(dǎo)的NF-κB活化,一種可能的抗炎機(jī)制可以歸因于rbLBP對(duì)LPS介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活的負(fù)調(diào)控。5 rbLBP和rbM-LBP對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的影響本試驗(yàn)通過(guò)重組牛脂多糖結(jié)合蛋白(rbLBP)和重組牛點(diǎn)突變脂多糖結(jié)合蛋白(rbM-LBP)分別作用于LPS誘導(dǎo)的牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型,探討其可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,20μg/mL的rbLBP、rbM-LBP分別下調(diào)LPS誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞中IL-1β和TNF-αmRNA表達(dá),均抑制乳腺上皮細(xì)胞TNF-α和IL-1β的分泌;均顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4、NF-κB(P65)的mRNA和蛋白表達(dá)(P0.05),抑制NF-κB(P65)的活化。20μg/mL的rbLBP和rbM-LBP均顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞早期凋亡(P0.05)。20μg/mL的rbLBP與rbM-LBP比較,對(duì)相關(guān)因子的影響效果差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明,LBP在乳腺上皮細(xì)胞抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的機(jī)制,可能與其中和LPS活性、下調(diào)TLR4表達(dá)、抑制NF-κB信號(hào)激活、抑制炎癥因子分泌和表達(dá)有關(guān)。重組的兩個(gè)蛋白,rbLBP與rbM-LBP對(duì)炎癥相關(guān)因子的影響效果差異不顯著。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S823

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本文編號(hào)：2243805