【摘要】：高致病性禽流感病毒為甲型流感病毒,主要在禽類中傳播。近年來不斷有人類感染高致病性禽流感并引起死亡的報導(dǎo),也有其他物種如豬、犬、貓、虎、豹等感染的報導(dǎo)。該病毒的跨物種傳播引起了人們的廣泛關(guān)注。本試驗分離到一株高致病性虎源流感毒株,研究了其生物學(xué)特性,并對其來源進(jìn)行了追溯。1流感病毒H5N1亞型虎源株的分離某動物園飼養(yǎng)的孟加拉國虎突然死亡,熒光PCR鑒定為流感病毒H5N1亞型,用SPF雞胚從該虎肺臟中分離到一株流感病毒H5N1亞型,命名為A/Tiger/Jiangsu/1/2013。將采集的虎組織病料做病理切片,顯示肝臟的中央靜脈區(qū)有壞死灶,脾內(nèi)動脈周圍淋巴鞘區(qū)域的淋巴細(xì)胞和邊上脾淋巴小結(jié)比較明顯稀少,肺臟的細(xì)支氣管內(nèi)有大量脫落的上皮細(xì)胞堵塞管腔。免疫組織化學(xué)切片顯示,肺泡內(nèi)有H5N1亞型流感病毒抗原存在,此為孟加拉虎感染H5N1高致病性禽流感病毒提供了組織學(xué)證據(jù)。2流感病毒H5N1亞型虎源株的核酸序列測定及致病性虎源分離株經(jīng)SPF雞胚純化,并測定其核酸序列。序列經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫比對,發(fā)現(xiàn)同源性最高的為2012年一個越南H5N1分離株:A/muscow duck/Vietnam/LBM/227/2012。測定純化后毒株的EID50,分別以101～106EID50的稀釋度接種BALB/c小鼠,并測定出小鼠組織中的病毒滴度,發(fā)現(xiàn)在肺組織中病毒滴度最高,用Reed-Muench法計算病毒對小鼠的半數(shù)致死量(MLD50),結(jié)果顯示在第8天時接種不同滴度的所有小鼠均已死亡,提示該毒株對小鼠的致病性極強(qiáng)。3虎源株的溯源樣本檢測推測飼喂市售的光雞可能是導(dǎo)致該虎感染的原因,但光雞來源無從查找。課題協(xié)作單位對周邊12個地市的活禽交易市場和大型養(yǎng)禽場展開流行病學(xué)調(diào)查,歷時一年,采集樣品1168份,樣品的種類包括肛拭、咽拭、洗禽污水、養(yǎng)殖飲水、糞便、裝禽的籠具和宰禽砧板拭子等。作者進(jìn)行了熒光PCR檢測,甲型流感病毒核酸陽性的樣品進(jìn)而分離和純化病毒,二代測序技術(shù)測定其序列。PCR檢測結(jié)果顯示陽性樣品總數(shù)為25例,其中常州和鎮(zhèn)江陽性樣本數(shù)量最多,均為6例,陽性率分別為3.8%和2.99%。最少的地區(qū)為淮安和泰州,均未能檢測到陽性樣品;樣品總體平均陽性率為1.8%。在所有樣品類型中宰殺禽類的砧板陽性檢出率最高,為3.53%,其次是籠具表面的拭子,為3.18%,洗禽的污水陽性率排列第三位,為3.09%,檢測率最低的是糞便,僅有1例,陽性率為0.62%。25份陽性樣品中共分離到流感毒株27株,有兩例樣品含有混合毒株。27株流感病毒亞型分布為:1株H3N2,1株H5N1,2株H5N6,1株H6N6,3株H5N8亞型,10株H7N9和9株H9N2。所有的分離株用Illumina MiSeq測序系統(tǒng)進(jìn)行全基因測序,測序結(jié)果用于毒株的遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建和遺傳演化分析。4.虎源株的遺傳學(xué)特性分析構(gòu)建H5亞型毒株各基因片段的遺傳進(jìn)化樹,分析H5亞型毒株各基因片段的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)H5N1亞型虎源株與2014年鎮(zhèn)江分離的H5N1亞型禽源株的7個片段在遺傳進(jìn)化樹上始終在同一分支上;在各片段氨基酸序列比較上,二者的HA1和HA2斷裂位點(diǎn)的氨基酸序列均符合高致病性禽流感毒株的特征;在HA序列上適應(yīng)哺乳動物受體的突變位點(diǎn)、HA和NA糖基化位點(diǎn)、NA耐藥性突變位點(diǎn)、宿主特異性位點(diǎn)及M1、M2、NS1、NS2、NP、PB1、PB2、PA等片段的致病性和耐藥性相關(guān)的突變位點(diǎn)二者也高度一致,這些分析結(jié)果證實,來自鎮(zhèn)江的H5N1亞型禽源株與H5N1亞型虎源株存在較高的遺傳演化關(guān)系,推測二者可能來自同一親本。在流感病毒H5亞型分離株的進(jìn)化樹圖中還發(fā)現(xiàn),虎源株的PB2片段與此次分離的流感病毒H5N8亞型南通株 EV/Nantong/1029/2014(H5N8)和鎮(zhèn)江株 EV/Zhenjiang/4342/2014(H5N8)在同一進(jìn)化支上,而非鎮(zhèn)江分離的H5N1亞型禽源株。這一結(jié)果提示,虎源株的PB2片段可能來自流感病毒H5N8亞型。5流感病毒H7N9與H9N2亞型毒株與H5亞型毒株內(nèi)部片段的比較本試驗分析的毒株中,H7N9亞型毒株數(shù)量最多,占了全部分離株的三分之一以上;其次為H9N2亞型毒株,數(shù)量占三分之一。據(jù)報道,H7N9亞型流感毒株的內(nèi)部片段全部來自H9N2亞型。這些毒株與分離鑒定的虎源株出現(xiàn)的時間非常接近,因此有必要分析H7N9亞型、H9N2亞型及其H5亞型毒株基因片段的遺傳演化關(guān)系。結(jié)果顯示,H7N9與H9N2亞型毒株的內(nèi)部6個片段的遺傳進(jìn)化樹中,流感病毒不同亞型的片段卻在同一分支上,這一現(xiàn)象提示,H7N9亞型毒株的內(nèi)部片段確實來自H9N2亞型,而且二者的PB2片段與H5亞型毒株的PB2片段也存在一定的遺傳演化關(guān)系。
[Abstract]:Highly pathogenic avian influenza viruses are mainly spread among birds. In recent years, there have been reports of human infection with highly pathogenic avian influenza and death. There are also reports of other species * such as pigs, dogs, cats, tigers, leopards, etc. the cross species transmission of the virus has attracted wide attention. Isolation of H5N1 subtype influenza virus strain from a zoo of Bangladesh tiger died suddenly. Fluorescent PCR was used to identify the H5N1 subtype influenza virus. A strain of influenza virus H5N1 subtype was isolated from the tiger's lung by SPF chicken embryo and named A/Tiger. / Jiangsu / 1 / 2013. Tiger tissue pathological sections showed necrosis in the central vein of the liver, marked rarity of lymphocytes in the lymphatic sheath around the splenic artery and peripheral splenic lymph nodules, and massive exfoliated epithelial cells in the bronchioles of the lungs. The presence of H5N1 subtype influenza virus antigens provided histological evidence for the infection of Bengal Tigers with H5N1 highly pathogenic avian influenza virus. Nucleic acid sequencing of H5N1 subtype tiger-origin influenza virus strains and purification of pathogenic tiger-origin isolates from SPF chicken embryos were carried out and their nucleic acid sequences were determined. A Vietnamese H5N1 isolate, A/muscow duck/Vietnam/LBM/227/2012, was isolated from Vietnam in 2012. EID50 of the purified strain was determined. BALB/c mice were inoculated with the dilution of 101-106 EID50 respectively. The viral titer in the lung tissue was the highest. Reed-Muench method was used to calculate the half lethal dose of the virus in mice (M LD50) results showed that all mice inoculated with different titers died on the 8th day, suggesting that the virus strain was highly pathogenic to mice. 3 Traceable samples of tiger-origin strain were tested and speculated that the bare chickens fed on the market might be the cause of the tiger infection, but the source of bare chickens could not be found. An epidemiological investigation was carried out in farms and large poultry farms over a period of one year. 1168 samples were collected, including anal swabbing, pharyngeal swabbing, poultry washing wastewater, aquaculture drinking water, feces, poultry cages and slaughter stock swabs. The authors carried out fluorescent PCR detection, isolation and purification of influenza A virus nucleic acid positive samples, and second-generation sequencing. PCR results showed that the total number of positive samples was 25, of which Changzhou and Zhenjiang had the largest number of positive samples, with the positive rates of 3.8% and 2.99% respectively. The smallest areas were Huaian and Taizhou, where no positive samples were detected; the overall average positive rate of the samples was 1.8%. The highest positive rate was found on the cutting board (3.53%), followed by the surface swabs of cages (3.18%), and the third was found in the sewage of poultry washing (3.09%). 1 strain H3N2, 1 strain H5N1, 2 strains H5N6, 1 strain H6N6, 3 strains H5N8 subtypes, 10 strains H7N9 and 9 strains H9N2. All the isolates were sequenced by Illumina MiSeq sequencing system. The sequencing results were used to construct the genetic evolution tree and analyze the genetic evolution of the H5 subtype strain. The amino acid sequence of each gene fragment of H5 subtype strain was analyzed. It was found that seven fragments of H5N1 subtype tiger strain and H5N1 subtype avian strain isolated from Zhenjiang in 2014 were always on the same branch in the genetic evolution tree. The characteristics of susceptible strains; HA and NA glycosylation sites, NA resistance mutation sites, host specific sites and M1, M2, NS1, NS2, NP, PB1, PB2, PA and other fragments of pathogenicity and resistance-related mutation sites are also highly consistent in HA sequence. These results confirmed that the H5N1 subtype from Zhenjiang. The phylogenetic tree of H5 subtype H5 isolates also showed that the PB2 fragment of H5 subtype H5 strain was related to the EV/Nantong/1029/2014 (H5N8) and Zhenjiang EV/Zhenjiang/4342/2014 (H5N8) of Nantong strain H5N8 and H5N8 subtype H5N8. The results suggest that the PB2 fragment of H5N1 subtype strain may come from the internal fragments of H7N9 and H9N2 subtypes of influenza virus H5N8 and H5 subtypes. Among the strains tested, H7N9 subtype was the most abundant, accounting for three of the total isolates. It is reported that the internal fragments of H7N9 subtype influenza virus strain are all from H9N2 subtype. These strains are very close to the origin of tiger strains, so it is necessary to analyze the genetic evolution of H7N9 subtype, H9N2 subtype and H5 subtype. The results showed that the fragments of influenza virus subtype H7N9 and H9N2 were in the same branch among the six internal segments of the evolutionary tree. This phenomenon suggested that the internal fragments of H7N9 and H9N2 subtypes were indeed from H9N2 subtype, and there was a certain genetic evolution relationship between their PB2 fragments and the PB2 fragments of H5 subtype.
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2227556