【摘要】：流感病毒的NS2蛋白能介導病毒核糖核蛋白復合體(vRNP)的核輸出過程,并且能夠調(diào)控病毒聚合酶的活性,參與禽流感病毒在哺乳動物宿主體內(nèi)的適應過程。但相對于流感病毒其余蛋白質(zhì)來講,NS2的研究鮮有報道。經(jīng)過本研究捕獲到新的與流感病毒NS2相互作用的宿主蛋白,不但拓展了流感病毒與宿主因子的相互作用網(wǎng)絡,而且為進一步探索流感病毒的復制周期和致病及免疫機制奠定了基礎(chǔ)。酵母雙雜交系統(tǒng)作為蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典技術(shù),已被應用于宿主蛋白與流感病毒蛋白的相互作用研究。本試驗采用該技術(shù)為基礎(chǔ),以H5N1流感病毒的NS2蛋白作為“誘餌”蛋白,從含有Calu-3、A549、THP-1和U251四種細胞的混合cDNA文庫中挑選出其相互作用蛋白,研究互作的生物學功能。主要研究內(nèi)容如下:(1)以禽流感病毒A/Anhui/02/2005(H5N1)NS2蛋白為誘餌,從含有Calu-3、A549、THP-1和U251四種細胞的混合cDNA文庫中篩選與其相互作用的蛋白將H5NS2克隆于pGBKT7中,轉(zhuǎn)化酵母菌Y2HGold,檢測誘餌質(zhì)粒無細胞毒性以及不存在自激活現(xiàn)象后,將pGBKT7-H5NS2/Y2HGold與4種細胞系的Y187cDNA文庫進行雜交,經(jīng)過篩選最后共捕獲到7種蛋白,分別為HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B。根據(jù)Gene Ontology分析結(jié)果,這些蛋白分別參與細胞生長發(fā)育、細胞代謝和細胞定位等過程。(2)免疫共沉淀(Co-IP)驗證其相互作用在實踐中選擇了7種蛋白中的過氧化物氧還酶3(PRDX3)進行了更為深入的研究。將H5NS2、PRDX3分別克隆于pEGFP-C1、pCAGGS中,在293T細胞中共轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pCAGGS-myc-PRDX3或pEGFP-C1-H5NS2和pCAGGS-myc-PRDX3質(zhì)粒,進行Co-IP及Western blot檢測。結(jié)果顯示在293T細胞中,外源表達的H5NS2蛋白和PRDX3蛋白擁有特異性的相互作用。(3)GST pull-down進一步驗證其相互作用將H5NS2克隆于pGEX-6p-1中,并在大腸桿菌中表達制備GST-H5NS2重組蛋白和GST標簽蛋白。以GST-H5NS2融合表達蛋白為誘餌或者作對照的GST蛋白與轉(zhuǎn)染pCAGGS-myc-PRDX3質(zhì)粒的293T細胞的細胞裂解液孵育,進行GSTpull-down。通過GST pull-down試驗結(jié)果顯示,H5NS2蛋白與PRDX3存在特異的,直接的相互作用。為進一步研究兩者之間相互作用如何影響NS2蛋白功能以及病毒的復制周期奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The NS2 protein of influenza virus can mediate the nuclear exportation process of ribonucleoprotein complex (vRNP) and regulate the activity of virus polymerase and participate in the adaptation process of avian influenza virus in mammalian host. But relative to the rest of the influenza virus protein, the study of NS2 is rarely reported. Through this study, a new host protein interacting with influenza virus NS2 was captured, which not only expanded the interaction network between influenza virus and host factor, It also lays a foundation for further exploring the replication cycle, pathogenesis and immune mechanism of influenza virus. Yeast two-hybrid system, as a classical technique of protein interaction, has been applied to study the interaction between host protein and influenza virus protein. On the basis of this technique, the interaction proteins of H5N1 influenza virus NS2 protein were selected from the cDNA library containing Calu-3,A549,THP-1 and U251 cells, and the biological function of the interaction was studied. The main contents are as follows: (1) using the A/Anhui/02/2005 (H5N1) NS2 protein of Avian Influenza virus as bait, the H5NS2 was cloned into pGBKT7 by screening the interacting proteins from the cDNA library containing four kinds of Calu-3,A549,THP-1 and U251 cells. After transforming yeast Y2H Gold. to detect the non-cytotoxicity and self-activation of the bait plasmid, the pGBKT7-H5NS2/Y2HGold was hybridized with the Y187cDNA library of four cell lines. After screening, seven proteins, HGS,EXOSC4,ZWINT,PRDX3,IRF3,NDUFB9 and RMND5B., were obtained. According to Gene Ontology analysis, these proteins are involved in cell growth and development, (2) Immunoprecipitation (Co-IP) confirmed that the interaction of the seven proteins, peroxoredoxin 3 (PRDX3), was further studied in practice. H5N1 NS2P PRDX3 was cloned into pEGFP-C1,pCAGGS and co-transfected with pEGFP-C1 and pCAGGS-myc-PRDX3 or pEGFP-C1-H5NS2 and pCAGGS-myc-PRDX3 plasmids in 293T cells for Co-IP and Western blot detection. The results showed that there was a specific interaction between exogenous H5NS2 protein and PRDX3 protein in 293T cells. (3) GST pull-down further confirmed that the H5NS2 was cloned into pGEX-6p-1 and expressed in Escherichia coli to produce GST-H5NS2 recombinant protein and GST label protein. Using GST-H5NS2 fusion protein as bait or as control, GST protein was incubated with 293T cell lysate transfected with pCAGGS-myc-PRDX3 plasmid to carry out GSTpull-down.. The results of GST pull-down test showed that there was a specific and direct interaction between H 5NS2 protein and PRDX3. It provides a basis for further study on how the interaction affects the function of NS2 protein and the replication cycle of the virus.
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65

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本文編號：2227312